局灶性皮质发育不良(Focal cortical dysplasias, FCDs)是儿童难治性癫痫的常见病因,也是常需癫痫手术的原因。尽管近年来在细胞和分子生物上的进展,FCDs的病理机制仍不清楚。该研究旨在回顾FCDs的分子机制,系统地检索FCDs组织、分子和电生理方面的文献,以明确可能的治疗靶点。哺乳动物雷帕霉素靶蛋白信号通路(mammalian target of rapamycin,mTOR)是一些FCDs结构和电生理紊乱的重要机制。其他的假说包括病毒感染、早产、头部外伤和脑肿瘤。mTOR抑制剂(如:雷帕霉素)在动物和少量FCDs患者的队列癫痫控制中取得阳性结果。近期研究在发育不良组织细胞的分子和电生理机制方面取得了令人鼓舞的进展。尽管mTOR抑制剂有良好的治疗前景,但仍需大规模的随机对照研究评估其有效性和不良反应,并且需要基础研究发现新的分子水平诊断和治疗方式。
引用本文： IsaacMarin-Valencia, RenzoGuerrini, JosephG Gleeson, 迟潇洒, 慕洁. 局灶性皮质发育不良的病理机制. 癫痫杂志, 2016, 2(6): 544-551. doi: 10.7507/2096-0247.20160095 复制
人类大脑皮质的发育经过细胞增殖、分化、迁移、突触发生和重组形成一个功能性皮层。皮层组合的破坏可以导致皮质发育畸形(Malformations of cortical development,MCDs)。MCDs可导致多种疾病，其病理类型取决于发病机制和发病时间。这些病理改变与难治性癫痫、认知损害和运动、感觉损害有关。
局灶性皮质发育不良(Focal cortical dysplasias,FCDs)是MCDs的亚组之一，以异常皮质分层和神经元迁移、生长和分化异常为特征，可累及一个独立脑区、几个脑叶甚至整个半球。FCDs常导致难治性癫痫，也是癫痫手术中最常见的皮质畸形。FCDs与基因突变的关系，特殊分子通路的参与，其对皮质发育和癫痫潜在机制的启示仍在深入研究中。近期的研究发现哺乳动物雷帕霉素靶蛋白信号通路(mammalian target of rapamycin,mTOR)活化与FCDs神经元细胞结构和电生理性质有关，可能说明癫痫产生和皮层紊乱机制。在此我们研究了FCDs的分子机制以探究诊断和治疗方法的潜在靶点。
1 神经病理和临床放射相关研究
FCDs代表性地展示了不同程度紊乱的皮质分层，组成细胞反过来通过皮质展示了形态学改变和/或异常组织。这些结果最初是在难治性癫痫患者术后切除的发育不良组织中发现。早期的报道发现扩大的圆形神经元(发育不良细胞)在受累皮层除第一层以外的各层分布，而气球样细胞是畸形细胞，位于皮层深处靠近白质，表现为过多的胞浆环绕多个胞核。此后，研究者基于新的组织学发现提出了几个分类方法。然而，不同的命名方法导致对组成细胞定义不一致，对后期其电生理特性和蛋白表达的研究有一定影响。
为了建立全球共识，国际抗癫痫联盟(ILAE)在2011年发布了一个三级分类系统，不仅基于组织学特征，综合考虑临床和神经影像表现。该分类方法逐渐被FCDs分子基础研究所接受(表 1)。目前假说认为FCDⅠ型和Ⅲ型是由于迁移后期发生的皮质缺陷或损伤。根据该分类标准，FCDⅠ型患者通常有严重的早产史、缺氧-缺血损伤、头部外伤、颅内出血或产前、围产期卒中史。患者通常表现为精神运动发育迟滞、局灶性功能损害和耐药性癫痫。FCDⅠ型被认为是一种独立的畸形，其异常皮层分层可呈放射型(Ⅰa)、切线型(Ⅰb)和混合型(Ⅰc)见图 1。神经元密度通常增加，伴有皮层厚度减小和神经元微柱富集。核磁共振(MRI)表现为局灶性皮质发育不良，偶尔可见皮层下白质中等异常信号(图 1)。另一方面，按照新的FCD分类，FCDⅢ型包括多种病理条件。FCDⅢ型与发育早期的原发病理类型有关，比如海马硬化(Ⅲa)，引起癫痫的肿瘤例如神经节胶质细胞瘤(Ⅲb)，临近血管畸形(Ⅲc)和包括头部外伤、缺氧缺血损伤和脑炎导致的致痫灶(Ⅲd)。这些病变通常在MRI上表现为异常特征，尽管不总是具有因果关系。
图1
FCD Ⅰa、Ⅱb型神经影像和组织学特征冠状位MRI T2相示左颞叶内侧皮质发育不良(箭头所示)，与FCD Ⅰa型相符(上层)。切除标本NeuN染色(神经元标志)示缺少正常分层而表现为特征性的神经元放射性分布(×10)。冠状面FLAIR相提示FCDⅡb型右顶叶皮质增厚，皮质及皮质下高信号。皮质下高信号延伸至右侧脑室边缘(倒三角征象)。切除标本苏木精伊红染色示典型的气球样细胞(×20)
表1
FCD分型：2011年国际抗癫痫联盟(ILAE)根据 FCD病理的认知发布
另一方面，FCDⅡ型是由异常细胞发育和成熟导致，其特征表现为形态异常神经元和典型的皮质分层紊乱和气球样细胞。FCDⅡ型进一步分为无气球样细胞的Ⅱa型和气球样细胞的Ⅱb型(图 1)。因此气球样细胞成为FCDⅡb型的决定性细胞种类，也可存在于皮质结节(又称为巨细胞)和半侧巨脑畸形(Hemiegalencephaly,HME)。临床特征表现为较小年龄时即出现耐药性癫痫，高度认知功能下降，但手术预后比FCDⅠ型好。最常见的MRI表现为皮层增厚、异常沟回和皮层下白质高信号延续至侧脑室边缘，形成所谓的穿通征(图 1)。穿通征有灰白质分界不清、皮层增厚和脑沟底部发育不良，最常见于FCDⅡb型。术后癫痫控制效果较好。然而这种良好的预后是由于本身致癫作用低还是解剖学上更易识别仍不清楚。
FCDⅡ型不同于FCDⅠ型的另一个特征是，深层皮层细胞表达未成熟标志物，且在皮质表层极少表达祖蛋白质。气球样细胞表达的标志物是神经元特异性核蛋白(Neuronal nuclei,NeuN)、微管相关蛋白1B(Microtubule-associated protein 1B,MAP1B)、波形蛋白、巢蛋白、α-微管连接蛋白和胶质纤维酸性蛋白(Glial fibrillary acidic portein，GFAP)，表明这些细胞不成熟性和/或混合细胞系来源。此外，气球样细胞也表达干细胞标志物，例如Sox2，Oct4，c-Myc和Klf4，这个特征与增强mTOR信号通路有关。总而言之，FCDⅡ型中细胞分化损害是皮质畸形的组织学特征。
2 发病机制
尽管组织病理分类是定义FCDs分型的基础为出发点，但根据细胞和分子机制新发现更新目前的分类也很重要。因此，我们回顾了FCDs的分子生物学和电生理研究，强调其可能的治疗靶点。
2.1 哺乳动物雷帕霉素靶蛋白及相关通路
mTOR信号通路与很多皮质畸形的病理机制有关。mTOR是一种进化保守的丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶，是发育和成熟阶段的重要调节者，调控细胞生长、增殖、能量代谢、炎症和抑制自噬。mTOR也是整合多种细胞内外信号的关键调控点，包括营养素、生长因子、细胞因子、激素、细胞应激源和氧传感器(图 2)。mTOR由两个蛋白复合物组成，mTORC1和mTORC2。mTORC1对雷帕霉素敏感且通过磷脂酰肌醇3-激酶 (Phosphoinositide3-kinase，PI3K)-蛋白激酶 (Protein kinase B，AKT)信号通路整合多种信号。mTORC1通过激活下游信号通路，例如核糖体蛋白S6(Ribosomal protein S6)-核糖体蛋白，S6激酶-1(Ribosomal protein S6 kinase beta-1，S6 K1)信号通路和蛋白翻译起始因子4E结合蛋白(Initiation factor 4E binding protein-1，4E-BP1)-蛋白翻译起始因子4E(Eukaryotic translation initiation factor 4E，eIF4E) 通路。另一方面，mTORC2对雷帕霉素相对不敏感，调控细胞骨架等不同激酶。mTORC1和mTORC2由上游调控基因抑制，包括抑癌基因结节性硬化复合物1(Tuberous sclerosis complex1，TSC1)和结节性硬化复合物2(Tuberous sclerosis complex2，TSC2)，同源性磷酸酶-张力蛋白基因(Phosphatase and tensin homolog，PTEN)，神经纤维素1基因(Neurofibromin1，NF1)和STRADA基因(STE20-related kinase adaptor alpha,STRADA)，见图 2、3。
图2
mTOR信号通路哺乳动物雷帕霉素靶蛋白复合物(mammalian target of rapamycin,mTOR)，特别是mTORC1，整合包括生长因子、激素和能量状态的多条信号通路。第一层整合发生在TSC1/TSC2复合物，包括RAS-MAKP、PI3K-AKT-mTOR和AMPK等信号通路。根据活化程度不同，TSC1/TSC2通过大脑内丰富的Ras同系物负性调节mTOR。mTOR依次调节下游底物(S6KI/S6，4E-BPI/eIF4E)，其下游底物进而控制蛋白合成、细胞生长和能量代谢。信号通路中其他重要调控蛋白(PTEN、NF-1和STRADA)的作用位点如图所示
注：Grb2，生长因子受体结合蛋白2；SOS，交换因子；RAS，大鼠肉瘤蛋白；RAF 迅速加速纤维肉瘤；MEK，MAPK/ERK激酶；ERK，细胞外信号调节激酶；PIK3，磷酸肌醇3激酶；PIP2，4,5-二磷酸磷脂酰肌醇；PIP3，3,4,5-三磷酸磷脂酰肌醇；PDK1，3磷酸肌醇依赖性蛋白激酶1；AKT，蛋白激酶B；AMPK，腺苷酸活化蛋白激酶；LKB1，肝激酶B1；STAMBP，STAM结合蛋白；NF-1，神经纤维蛋白1；PTEN，同源性磷酸酶-张力蛋白；STRADA，STE20相关激酶调控蛋白α；TSC1/2，结节性硬化蛋白1/2，S6KI，核糖体蛋白S6激酶1；S6，核糖体蛋白S6；4E-BP1，4E结合蛋白1；eIF4E，真核细胞翻译起始因子4E
图3
mTOR信号通路在皮质发育不良和癫痫发生中的作用mTOR信号通路编码上游调控蛋白(TSC1，TSC2，STRADA,PTEN或者NF-1)的基因突变可使通路过度激活(粗线所示)，信号通路的组成部分RAF、AKT、PI3K和mTOR(红色所示)在TSC1/2整合。近期研究发现HPV16E6以及其他DNA病毒在FCD Ⅱa和FCD Ⅱb中的作用提示感染可能是FCD病理的病因。同时，mTOR信号通路激活导致异常细胞生长和增殖，导致皮质发育不良的解剖病变。此外，mTOR信号通路活化能修饰神经递质受体和离子通道表达，改变细胞膜特性和突触结构，因此导致神经元过度兴奋。这些细胞和电流水平形态和功能上的改变可能导致皮质发育不良患者癫痫，局灶缺陷和认知障碍
在发现TSC1和TSC2对mTOR的抑制作用之后，结节性硬化患者分子结构异常能够激活mTOR信号通路。FCDⅡb型与神经结节在组织结构上的相似提示mTOR信号通路可能是FCDs的潜在病因。事实上，mTOR信号通路活化以下游S6K1和S6分子磷酸化增高为标志，先在FCDⅡb型中发现，而后在HME和神经节胶质瘤中发现。mTOR信号通路尤其是在FCDⅡb型和神经结节明显，其中＞80%的气球样细胞和巨细胞表现为S6K1和S6磷酸化增强。相反，FCDⅠ型未发现mTOR信号通路增高。一些FCDⅡb型病例也表现出上游磷酸酰肌醇3依赖性激酶(Phosphoinositide-3-dependent kinase 1，PDK1)和AKT，和下游底物血管内皮生长因子(Vascular endothelial growth factor，VEGF)和信号转导和转录激活因子3(Signal transducer and activator of transcription 3，STAT3)。mTOR信号通路在FCDs的病理生理机制中的作用通过PTEN基因敲除小鼠模型进一步证实。这些动物与FCDs的组织学特征类似，且很多可以被雷帕霉素抑制。
近年来，人乳头病毒(Human papilloma virus，HPV)癌蛋白E6在一组FCDⅡb型患者中检测到，证明FCDs可能与病毒感染有关。在切除组织中，E6与磷酸化S6蛋白主要共同表达在气球样细胞中，提示HPV16可能通过mTOR改变皮质发育(图 3)。这一发现通过HPV16转染胚胎期的小鼠进一步证实，被转染的小鼠表现出局灶性皮质发育畸形伴有磷酸化S6表达增高。
目前，两个机制与HPV16 E6癌蛋白和mTORC1活化相关：① HPV16 E6癌蛋白与TSC2结合并促进其泛素介导的降解；② 活化PDK1和AKT，随后抑制TSC1/TSC2。PI3K-AKT-mTOR信号通路被证实通过调控蛋白翻译，促进巨细胞病毒(Cytomegalovirus，CMV)，单纯疱疹病毒(Herpes simplex virus，HSV-1)和其他双链DNA病毒复制，可能感染其它细胞。最近的一个研究在18/20例FCDⅡb型患者和6/27例FCDⅡa型切除的病变组织中检测到HPV16病毒。在一些组织的气球样细胞和发育异常神经元检测也得到其他的病原体例如CMV，HSV-1和人类疱疹病毒6B(HHV-6B)。目前仍需要更多研究证实病毒感染在FCDs发病机制中的作用；并阐明传播方式，感染时机和传播机制；评估其在皮质发育不良中的流行病学作用。
基于mTOR信号通路的广泛作用，一些发育性脑肿瘤与FCDs、癫痫和mTOR信号通路活化相关并不意外。神经节胶质瘤就符合这种情况，且其为最常见的合并难治性癫痫的儿童脑肿瘤。该肿瘤可直接或间接与FCDs相关，并且基于其致痫性归类于FCDⅢb型。在组织学上，神经节胶质瘤由多种神经元发育异常细胞和肿瘤胶质细胞组成。非典型神经节细胞也被观察到和气球样细胞有类似的组织学特征和蛋白表达。
mTOR信号通路在神经节胶质瘤病理机制中的作用首先由神经元和非典型节细胞中磷酸化S6K1和S6表达增高证实。这一发现进一步由磷酸化的上游PDK1，AKT因子、mTOR及下游4E-BP1，eIF4G，S6K1和S6增高证实。如同黑色素瘤，节细胞胶质瘤mTOR信号通路活化的机制可能是RAF-MEK和PI3K-AKT-mTOR信号通路的双重作用(图 3)。 近期研究发现有20%～60%的神经节胶质瘤携带鼠类肉瘤滤过性毒菌致癌同源体B1基因V600E突变，尤其是在神经元和非典型节细胞。这一发现提供了治疗的可能，因为在其他肿瘤中抑制着两条信号通路能显著降低细胞的生存率。
mTOR信号通路的其他调控因子或组成部分在其他皮质发育畸形的病理机制中发挥重要作用。例如，在HME和多小脑回畸形巨脑畸形脑积水综合征(Megalence phaly polymicrogyria polydactyly hydrocephalus，MPPH)患者的脑组织中发现了PI3K，AKT3或mTOR体细胞突变。研究已在羊水过多伴巨脑、症状性癫痫综合征(Polyhydramnios megalencephalyand symptomatic epilepsy syndrome，PMSE)发现STRADA突变。另一方面，RAS-MAPK和PI3K-AKT-mTOR的功能紊乱在皮质发育不良中发挥作用。并且这两条信号通路在不同程度上相互联系，例如，通过STAM结合蛋白(STAMBP-binding protein，STAMBP)和生长因子受体结合蛋白2(Growth factor receptor-bound protein 2，Grb2)，见图 2。STAMBP突变与脑小及血管畸形综合征(Microcephaly capillary malformation syndrome，MIC-CAP)患者中RAS-MAPK和PI3K-AKT-mTOR信号通路功能增强有关(图 3)，表明了信号通路在细胞生长、增殖和血管生成中的作用。
2.2 局灶性皮质发育不良的致痫性
痫性发作是FCDs中最常见和具有挑战性的临床表现之一。在过去的十年，研究在发育不良皮质及其周围神经元细胞的电生理特性以及异常分子信号通路与神经元过度兴奋之间的联系取得了令人振奋的发展。在获得性癫痫的多个动物模型中，例如颞叶癫痫和婴儿痉挛症，均检测到mTOR信号通路激活，且雷帕霉素可抑制其癫痫发作，表明mTOR信号通路在癫痫发生中的作用。
目前争论的焦点在于痫性发作起源于FCDs，还是起源于其周围脑组织抑或是两者均有仍不清楚。这是一个值得注意的问题，相当一部分患者在切除病变组织后仍有难治性癫痫。通过对儿童患者新切除皮质发育不良脑切片进行电生理活动记录，结果发现并不是所有神经元细胞表现为异常电生理特征。在这些脑组织中，大椎细胞由于充足的Ca2+电流和去极化时流入表现为兴奋性增高，而形态异常和未成熟椎体细胞未表现出异常电活动。气球样细胞自身并未表现出兴奋性，但是这些电活动“沉默”细胞能够促进周围皮质的突触重组，进而导致脑组织兴奋网络。
其中一个潜在的机制是FCDs神经元兴奋性增高是由于发育不良神经元的谷氨酸能受体表达增高所致，例如N-甲基-D-天冬氨酸(N-methyl-D-aspartate，NMDA)受体亚基NR1-1a，1b，2a，2b，NR2A/B，NR2B和α-氨基-3-羟基-5-甲基异恶唑-4-丙酸(a-Amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic acid，AMPA)受体亚单位GluR1和GluR2/3。然而，有研究报道谷氨酸能受体表达程度不同，这可能是由于组织学命名或实验条件不同。对FCDs的超微结构研究发现，其突触密度和兴奋/抑制神经元比例与邻近皮质有明显差异，这可能导致发育不良皮质及皮质周围神经元环路的改变引起癫痫发生。根据对FCDs患者颅内脑电图记录结果发现，致痫灶可以延伸到影像学识别的损伤之外，并且其对邻近或远处区域传播方式复杂。FCDs的电活动模式比其他病理改变更有特征性，尤其是发作期。例如，FCDs颅内监测的典型活动为发作期和发作间期阵发、低电压、快速电活动，阵发快波或多棘波，反过来也表征了发作区域。其他代表发作起源的形式包括棘慢波活动，爆发性多棘波和delta刷。
另一个可能的机制是FCD所致的难治性癫痫的机制为多耐药蛋白(Multidrug resistance gene-1 /p-glycoprotein，MDR1)和多耐药相关蛋白1(Multidrug resistance-associated protein-1，MRP1)在发育不良皮质中神经元、星形细胞、发育不良神经元和气球样细胞表达增高。多药耐药蛋白(Multidrug-resistant proteins，MDRP)可将神经系统的抗癫痫药物(AEDs)清除，因此降低了脑内有效药物浓度。然而，目前仍不清楚致痫灶中这些转运蛋白的表达增高是原发还是继发于慢性癫痫还是AEDs使用。
2.3 局灶性皮质发育不良引起的癫痫：来源于结节性硬化症的经验
结节性硬化症(Tuberous sclerosis complex，TSC)是由于mTOR调控基因TSC1或TSC2突变所致常染色体显性疾病。这种突变是皮质结节形成的典型机制，在组织学上与一些FCDs相似并且总是与难治性癫痫相关联。由于mTOR信号通路在其病理机制中的明确作用，TSC成为研究FCD癫痫发生的有价值的模型。在这种意义上，TSC2突变使谷氨酸介导的神经元兴奋性增高，且TSC患者术后切除的发育不良脑组织显示兴奋性增高。这一发现在TSC敲除小鼠进一步证实，全细胞膜片钳发现AMPA介导的兴奋性突触电流增高。另一方面，由于谷氨酸受体表达不同，异常神经元和胶质细胞比例在神经结节癫痫发生机制中发挥重要作用。因此，表达异常AMPA和NMDA受体的发育不良神经元比例高的神经结节相比主要为巨细胞或发育不良星形胶质细胞的神经结节更容易产生癫痫。
TSC痫性发作的机制与谷氨酸内环境功能失调有关。星形细胞特异性TSC1失活的小鼠表现为进展性癫痫，这可能是由于星形细胞谷氨酸转运体(GLT-1和GLAST)表达降低和通过内向整流钾通道摄取细胞外K+功能受损所致。这种与高致痫性的关系在GLT-1基因敲除小鼠中进一步证实，表明星形细胞突触谷氨酸清除受损能够增强兴奋性突触传递，进而增强了TSC的癫痫发生。
3 局灶性皮质发育不良的靶向治疗
目前FCDs的治疗仍主要为对症治疗。因为FCD引起的癫痫发作经常对AEDs耐药，所以需要癫痫手术治疗。手术切除发育不良组织可使50%～80%的患者达到癫痫缓解，与FCDs类型、年龄和切除的方式有关。但是，相当一部分患者在术后仍有发作，且一小部分患者合并术后并发症。因此，目前仍需要新的基于分子水平的治疗。
由于mTOR参与除了FCD以外的多种人类疾病，研究者不断努力探求靶向mTOR信号通路的方法。目前使用最多的抑制mTOR的药物为雷帕霉素类似物，包括雷帕霉素及其类似物西罗莫司和依维莫司。这些抑制物特异性作用于mTORC1，降低其下游效应器的生理作用，阻止异常细胞生长，突触发芽和神经元固有兴奋性增高伴mTOR信号通路激活。就这点而言，雷帕霉素慢性给药能通过阻滞突触电活动、降低AMPA受体表达及增加GABAA受体介导的神经传导，从而降低皮质兴奋性。此外，雷帕霉素也通过延长Ca2+依赖K+通道开放时间，增加皮质及海马神经元电压门控钾通道Kv1.1表达，降低神经元固有兴奋性。
雷帕霉素潜在的抗癫痫作用已经在皮质发育不良动物模型中进行评估。在灭活TSC1小鼠中，早期使用雷帕霉素能防止癫痫发作和过早死亡，而后期使用可减少癫痫发作并延长生存率。而且雷帕霉素在TSC2失活性突变小鼠中使用可改善突触可塑性和行为缺陷。在PTEN敲除小鼠中，雷帕霉素显著抑制痫性发作的严重程度和持续时间，防止神经元过度肥大并延长其存活率。雷帕霉素已成功用于mTOR相关疾病，例如，雷帕霉素能防止细胞系迁移缺损。然而这一理想的效果未在其他动物模型中观察到。例如，雷帕霉素不能减弱匹罗卡品诱导的痫性发作严重程度及频率。这表明mTOR信号通路的激活可能不是所有癫痫类型的关键机制，因此，雷帕霉素可能不产生广谱抗癫痫作用。
按照推论，mTOR抑制剂近期被用于FCDs患者中。例如，雷帕霉素的使用明显降低一例患有TSC的儿童痫性发作时间和频率，且在一个开放性研究中发现能减少TSC患者室管膜下巨大星形细胞瘤(Subependymal giant astrocytomas，SEGAs)大小。另一方面，在PMSE患者中雷帕霉素明显降低癫痫发作频率并提高接受性语言能力。然而大规模试验需评估雷帕霉素的效能和不良反应，尤其是FCDs患者。
其他的治疗方法仍处于研究阶段。例如，MDR1抑制剂(维拉帕米)在难治性癫痫患者中使用，可部分减弱癫痫发作频率和严重程度。部分FCDs患者中使用维拉帕米有利于癫痫控制。在另一方面，雷帕霉素合并RAF-MEK抑制剂可能是神经节胶质瘤的潜在治疗方法，因为这一靶向治疗和结肠癌这两条通路显著降低肿瘤细胞存活率。最近病毒感染与FCDs之间的关系为发现其他治疗方法提供新思路。总之，FCDs分子机制的新进展为精准医疗提供可能，可针对每种疾病中特定的靶向特定信号通路，离子通道，神经递质受体或转运蛋白，因而将相关副反应降至最低。
4 展望
FCDs因其可能的因果异质性，对患者神经功能的影响和缺乏精确的治疗方式仍然是临床医生的挑战。发现mTOR信号通路在FCDs和其他皮质畸形的机制中作用为有效的治疗方式提供了可能。尽管mTOR抑制剂在动物模型和患者癫痫控制中取得结果较好，目前仍需要大规模随机对照试验评估其效能和长期副反应，尤其是在FCDs患者中。并且，在FCDs脑组织切片中检测到病毒病原体有利于理解这些病变的机制，发现新的预防、诊断和治疗方法。为此，接下来的研究需证实病毒在皮质发育不良中的致病作用，并解答传播途径，流行时机和传播机制等问题。在另一方面，FCDⅠ、Ⅲ型的病因异质性提示有多种可能的致病机制。然而其解剖上和临床表现上的共同点仍难理解并成为未来需要解决的重要挑战。
人类大脑皮质的发育经过细胞增殖、分化、迁移、突触发生和重组形成一个功能性皮层。皮层组合的破坏可以导致皮质发育畸形(Malformations of cortical development,MCDs)。MCDs可导致多种疾病，其病理类型取决于发病机制和发病时间。这些病理改变与难治性癫痫、认知损害和运动、感觉损害有关。
局灶性皮质发育不良(Focal cortical dysplasias,FCDs)是MCDs的亚组之一，以异常皮质分层和神经元迁移、生长和分化异常为特征，可累及一个独立脑区、几个脑叶甚至整个半球。FCDs常导致难治性癫痫，也是癫痫手术中最常见的皮质畸形。FCDs与基因突变的关系，特殊分子通路的参与，其对皮质发育和癫痫潜在机制的启示仍在深入研究中。近期的研究发现哺乳动物雷帕霉素靶蛋白信号通路(mammalian target of rapamycin,mTOR)活化与FCDs神经元细胞结构和电生理性质有关，可能说明癫痫产生和皮层紊乱机制。在此我们研究了FCDs的分子机制以探究诊断和治疗方法的潜在靶点。
1 神经病理和临床放射相关研究
FCDs代表性地展示了不同程度紊乱的皮质分层，组成细胞反过来通过皮质展示了形态学改变和/或异常组织。这些结果最初是在难治性癫痫患者术后切除的发育不良组织中发现。早期的报道发现扩大的圆形神经元(发育不良细胞)在受累皮层除第一层以外的各层分布，而气球样细胞是畸形细胞，位于皮层深处靠近白质，表现为过多的胞浆环绕多个胞核。此后，研究者基于新的组织学发现提出了几个分类方法。然而，不同的命名方法导致对组成细胞定义不一致，对后期其电生理特性和蛋白表达的研究有一定影响。
为了建立全球共识，国际抗癫痫联盟(ILAE)在2011年发布了一个三级分类系统，不仅基于组织学特征，综合考虑临床和神经影像表现。该分类方法逐渐被FCDs分子基础研究所接受(表 1)。目前假说认为FCDⅠ型和Ⅲ型是由于迁移后期发生的皮质缺陷或损伤。根据该分类标准，FCDⅠ型患者通常有严重的早产史、缺氧-缺血损伤、头部外伤、颅内出血或产前、围产期卒中史。患者通常表现为精神运动发育迟滞、局灶性功能损害和耐药性癫痫。FCDⅠ型被认为是一种独立的畸形，其异常皮层分层可呈放射型(Ⅰa)、切线型(Ⅰb)和混合型(Ⅰc)见图 1。神经元密度通常增加，伴有皮层厚度减小和神经元微柱富集。核磁共振(MRI)表现为局灶性皮质发育不良，偶尔可见皮层下白质中等异常信号(图 1)。另一方面，按照新的FCD分类，FCDⅢ型包括多种病理条件。FCDⅢ型与发育早期的原发病理类型有关，比如海马硬化(Ⅲa)，引起癫痫的肿瘤例如神经节胶质细胞瘤(Ⅲb)，临近血管畸形(Ⅲc)和包括头部外伤、缺氧缺血损伤和脑炎导致的致痫灶(Ⅲd)。这些病变通常在MRI上表现为异常特征，尽管不总是具有因果关系。
图1
FCD Ⅰa、Ⅱb型神经影像和组织学特征冠状位MRI T2相示左颞叶内侧皮质发育不良(箭头所示)，与FCD Ⅰa型相符(上层)。切除标本NeuN染色(神经元标志)示缺少正常分层而表现为特征性的神经元放射性分布(×10)。冠状面FLAIR相提示FCDⅡb型右顶叶皮质增厚，皮质及皮质下高信号。皮质下高信号延伸至右侧脑室边缘(倒三角征象)。切除标本苏木精伊红染色示典型的气球样细胞(×20)
表1
FCD分型：2011年国际抗癫痫联盟(ILAE)根据 FCD病理的认知发布
另一方面，FCDⅡ型是由异常细胞发育和成熟导致，其特征表现为形态异常神经元和典型的皮质分层紊乱和气球样细胞。FCDⅡ型进一步分为无气球样细胞的Ⅱa型和气球样细胞的Ⅱb型(图 1)。因此气球样细胞成为FCDⅡb型的决定性细胞种类，也可存在于皮质结节(又称为巨细胞)和半侧巨脑畸形(Hemiegalencephaly,HME)。临床特征表现为较小年龄时即出现耐药性癫痫，高度认知功能下降，但手术预后比FCDⅠ型好。最常见的MRI表现为皮层增厚、异常沟回和皮层下白质高信号延续至侧脑室边缘，形成所谓的穿通征(图 1)。穿通征有灰白质分界不清、皮层增厚和脑沟底部发育不良，最常见于FCDⅡb型。术后癫痫控制效果较好。然而这种良好的预后是由于本身致癫作用低还是解剖学上更易识别仍不清楚。
FCDⅡ型不同于FCDⅠ型的另一个特征是，深层皮层细胞表达未成熟标志物，且在皮质表层极少表达祖蛋白质。气球样细胞表达的标志物是神经元特异性核蛋白(Neuronal nuclei,NeuN)、微管相关蛋白1B(Microtubule-associated protein 1B,MAP1B)、波形蛋白、巢蛋白、α-微管连接蛋白和胶质纤维酸性蛋白(Glial fibrillary acidic portein，GFAP)，表明这些细胞不成熟性和/或混合细胞系来源。此外，气球样细胞也表达干细胞标志物，例如Sox2，Oct4，c-Myc和Klf4，这个特征与增强mTOR信号通路有关。总而言之，FCDⅡ型中细胞分化损害是皮质畸形的组织学特征。
2 发病机制
尽管组织病理分类是定义FCDs分型的基础为出发点，但根据细胞和分子机制新发现更新目前的分类也很重要。因此，我们回顾了FCDs的分子生物学和电生理研究，强调其可能的治疗靶点。
2.1 哺乳动物雷帕霉素靶蛋白及相关通路
mTOR信号通路与很多皮质畸形的病理机制有关。mTOR是一种进化保守的丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶，是发育和成熟阶段的重要调节者，调控细胞生长、增殖、能量代谢、炎症和抑制自噬。mTOR也是整合多种细胞内外信号的关键调控点，包括营养素、生长因子、细胞因子、激素、细胞应激源和氧传感器(图 2)。mTOR由两个蛋白复合物组成，mTORC1和mTORC2。mTORC1对雷帕霉素敏感且通过磷脂酰肌醇3-激酶 (Phosphoinositide3-kinase，PI3K)-蛋白激酶 (Protein kinase B，AKT)信号通路整合多种信号。mTORC1通过激活下游信号通路，例如核糖体蛋白S6(Ribosomal protein S6)-核糖体蛋白，S6激酶-1(Ribosomal protein S6 kinase beta-1，S6 K1)信号通路和蛋白翻译起始因子4E结合蛋白(Initiation factor 4E binding protein-1，4E-BP1)-蛋白翻译起始因子4E(Eukaryotic translation initiation factor 4E，eIF4E) 通路。另一方面，mTORC2对雷帕霉素相对不敏感，调控细胞骨架等不同激酶。mTORC1和mTORC2由上游调控基因抑制，包括抑癌基因结节性硬化复合物1(Tuberous sclerosis complex1，TSC1)和结节性硬化复合物2(Tuberous sclerosis complex2，TSC2)，同源性磷酸酶-张力蛋白基因(Phosphatase and tensin homolog，PTEN)，神经纤维素1基因(Neurofibromin1，NF1)和STRADA基因(STE20-related kinase adaptor alpha,STRADA)，见图 2、3。
图2
mTOR信号通路哺乳动物雷帕霉素靶蛋白复合物(mammalian target of rapamycin,mTOR)，特别是mTORC1，整合包括生长因子、激素和能量状态的多条信号通路。第一层整合发生在TSC1/TSC2复合物，包括RAS-MAKP、PI3K-AKT-mTOR和AMPK等信号通路。根据活化程度不同，TSC1/TSC2通过大脑内丰富的Ras同系物负性调节mTOR。mTOR依次调节下游底物(S6KI/S6，4E-BPI/eIF4E)，其下游底物进而控制蛋白合成、细胞生长和能量代谢。信号通路中其他重要调控蛋白(PTEN、NF-1和STRADA)的作用位点如图所示
注：Grb2，生长因子受体结合蛋白2；SOS，交换因子；RAS，大鼠肉瘤蛋白；RAF 迅速加速纤维肉瘤；MEK，MAPK/ERK激酶；ERK，细胞外信号调节激酶；PIK3，磷酸肌醇3激酶；PIP2，4,5-二磷酸磷脂酰肌醇；PIP3，3,4,5-三磷酸磷脂酰肌醇；PDK1，3磷酸肌醇依赖性蛋白激酶1；AKT，蛋白激酶B；AMPK，腺苷酸活化蛋白激酶；LKB1，肝激酶B1；STAMBP，STAM结合蛋白；NF-1，神经纤维蛋白1；PTEN，同源性磷酸酶-张力蛋白；STRADA，STE20相关激酶调控蛋白α；TSC1/2，结节性硬化蛋白1/2，S6KI，核糖体蛋白S6激酶1；S6，核糖体蛋白S6；4E-BP1，4E结合蛋白1；eIF4E，真核细胞翻译起始因子4E
图3
mTOR信号通路在皮质发育不良和癫痫发生中的作用mTOR信号通路编码上游调控蛋白(TSC1，TSC2，STRADA,PTEN或者NF-1)的基因突变可使通路过度激活(粗线所示)，信号通路的组成部分RAF、AKT、PI3K和mTOR(红色所示)在TSC1/2整合。近期研究发现HPV16E6以及其他DNA病毒在FCD Ⅱa和FCD Ⅱb中的作用提示感染可能是FCD病理的病因。同时，mTOR信号通路激活导致异常细胞生长和增殖，导致皮质发育不良的解剖病变。此外，mTOR信号通路活化能修饰神经递质受体和离子通道表达，改变细胞膜特性和突触结构，因此导致神经元过度兴奋。这些细胞和电流水平形态和功能上的改变可能导致皮质发育不良患者癫痫，局灶缺陷和认知障碍
在发现TSC1和TSC2对mTOR的抑制作用之后，结节性硬化患者分子结构异常能够激活mTOR信号通路。FCDⅡb型与神经结节在组织结构上的相似提示mTOR信号通路可能是FCDs的潜在病因。事实上，mTOR信号通路活化以下游S6K1和S6分子磷酸化增高为标志，先在FCDⅡb型中发现，而后在HME和神经节胶质瘤中发现。mTOR信号通路尤其是在FCDⅡb型和神经结节明显，其中＞80%的气球样细胞和巨细胞表现为S6K1和S6磷酸化增强。相反，FCDⅠ型未发现mTOR信号通路增高。一些FCDⅡb型病例也表现出上游磷酸酰肌醇3依赖性激酶(Phosphoinositide-3-dependent kinase 1，PDK1)和AKT，和下游底物血管内皮生长因子(Vascular endothelial growth factor，VEGF)和信号转导和转录激活因子3(Signal transducer and activator of transcription 3，STAT3)。mTOR信号通路在FCDs的病理生理机制中的作用通过PTEN基因敲除小鼠模型进一步证实。这些动物与FCDs的组织学特征类似，且很多可以被雷帕霉素抑制。
近年来，人乳头病毒(Human papilloma virus，HPV)癌蛋白E6在一组FCDⅡb型患者中检测到，证明FCDs可能与病毒感染有关。在切除组织中，E6与磷酸化S6蛋白主要共同表达在气球样细胞中，提示HPV16可能通过mTOR改变皮质发育(图 3)。这一发现通过HPV16转染胚胎期的小鼠进一步证实，被转染的小鼠表现出局灶性皮质发育畸形伴有磷酸化S6表达增高。
目前，两个机制与HPV16 E6癌蛋白和mTORC1活化相关：① HPV16 E6癌蛋白与TSC2结合并促进其泛素介导的降解；② 活化PDK1和AKT，随后抑制TSC1/TSC2。PI3K-AKT-mTOR信号通路被证实通过调控蛋白翻译，促进巨细胞病毒(Cytomegalovirus，CMV)，单纯疱疹病毒(Herpes simplex virus，HSV-1)和其他双链DNA病毒复制，可能感染其它细胞。最近的一个研究在18/20例FCDⅡb型患者和6/27例FCDⅡa型切除的病变组织中检测到HPV16病毒。在一些组织的气球样细胞和发育异常神经元检测也得到其他的病原体例如CMV，HSV-1和人类疱疹病毒6B(HHV-6B)。目前仍需要更多研究证实病毒感染在FCDs发病机制中的作用；并阐明传播方式，感染时机和传播机制；评估其在皮质发育不良中的流行病学作用。
基于mTOR信号通路的广泛作用，一些发育性脑肿瘤与FCDs、癫痫和mTOR信号通路活化相关并不意外。神经节胶质瘤就符合这种情况，且其为最常见的合并难治性癫痫的儿童脑肿瘤。该肿瘤可直接或间接与FCDs相关，并且基于其致痫性归类于FCDⅢb型。在组织学上，神经节胶质瘤由多种神经元发育异常细胞和肿瘤胶质细胞组成。非典型神经节细胞也被观察到和气球样细胞有类似的组织学特征和蛋白表达。
mTOR信号通路在神经节胶质瘤病理机制中的作用首先由神经元和非典型节细胞中磷酸化S6K1和S6表达增高证实。这一发现进一步由磷酸化的上游PDK1，AKT因子、mTOR及下游4E-BP1，eIF4G，S6K1和S6增高证实。如同黑色素瘤，节细胞胶质瘤mTOR信号通路活化的机制可能是RAF-MEK和PI3K-AKT-mTOR信号通路的双重作用(图 3)。 近期研究发现有20%～60%的神经节胶质瘤携带鼠类肉瘤滤过性毒菌致癌同源体B1基因V600E突变，尤其是在神经元和非典型节细胞。这一发现提供了治疗的可能，因为在其他肿瘤中抑制着两条信号通路能显著降低细胞的生存率。
mTOR信号通路的其他调控因子或组成部分在其他皮质发育畸形的病理机制中发挥重要作用。例如，在HME和多小脑回畸形巨脑畸形脑积水综合征(Megalence phaly polymicrogyria polydactyly hydrocephalus，MPPH)患者的脑组织中发现了PI3K，AKT3或mTOR体细胞突变。研究已在羊水过多伴巨脑、症状性癫痫综合征(Polyhydramnios megalencephalyand symptomatic epilepsy syndrome，PMSE)发现STRADA突变。另一方面，RAS-MAPK和PI3K-AKT-mTOR的功能紊乱在皮质发育不良中发挥作用。并且这两条信号通路在不同程度上相互联系，例如，通过STAM结合蛋白(STAMBP-binding protein，STAMBP)和生长因子受体结合蛋白2(Growth factor receptor-bound protein 2，Grb2)，见图 2。STAMBP突变与脑小及血管畸形综合征(Microcephaly capillary malformation syndrome，MIC-CAP)患者中RAS-MAPK和PI3K-AKT-mTOR信号通路功能增强有关(图 3)，表明了信号通路在细胞生长、增殖和血管生成中的作用。
2.2 局灶性皮质发育不良的致痫性
痫性发作是FCDs中最常见和具有挑战性的临床表现之一。在过去的十年，研究在发育不良皮质及其周围神经元细胞的电生理特性以及异常分子信号通路与神经元过度兴奋之间的联系取得了令人振奋的发展。在获得性癫痫的多个动物模型中，例如颞叶癫痫和婴儿痉挛症，均检测到mTOR信号通路激活，且雷帕霉素可抑制其癫痫发作，表明mTOR信号通路在癫痫发生中的作用。
目前争论的焦点在于痫性发作起源于FCDs，还是起源于其周围脑组织抑或是两者均有仍不清楚。这是一个值得注意的问题，相当一部分患者在切除病变组织后仍有难治性癫痫。通过对儿童患者新切除皮质发育不良脑切片进行电生理活动记录，结果发现并不是所有神经元细胞表现为异常电生理特征。在这些脑组织中，大椎细胞由于充足的Ca2+电流和去极化时流入表现为兴奋性增高，而形态异常和未成熟椎体细胞未表现出异常电活动。气球样细胞自身并未表现出兴奋性，但是这些电活动“沉默”细胞能够促进周围皮质的突触重组，进而导致脑组织兴奋网络。
其中一个潜在的机制是FCDs神经元兴奋性增高是由于发育不良神经元的谷氨酸能受体表达增高所致，例如N-甲基-D-天冬氨酸(N-methyl-D-aspartate，NMDA)受体亚基NR1-1a，1b，2a，2b，NR2A/B，NR2B和α-氨基-3-羟基-5-甲基异恶唑-4-丙酸(a-Amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic acid，AMPA)受体亚单位GluR1和GluR2/3。然而，有研究报道谷氨酸能受体表达程度不同，这可能是由于组织学命名或实验条件不同。对FCDs的超微结构研究发现，其突触密度和兴奋/抑制神经元比例与邻近皮质有明显差异，这可能导致发育不良皮质及皮质周围神经元环路的改变引起癫痫发生。根据对FCDs患者颅内脑电图记录结果发现，致痫灶可以延伸到影像学识别的损伤之外，并且其对邻近或远处区域传播方式复杂。FCDs的电活动模式比其他病理改变更有特征性，尤其是发作期。例如，FCDs颅内监测的典型活动为发作期和发作间期阵发、低电压、快速电活动，阵发快波或多棘波，反过来也表征了发作区域。其他代表发作起源的形式包括棘慢波活动，爆发性多棘波和delta刷。
另一个可能的机制是FCD所致的难治性癫痫的机制为多耐药蛋白(Multidrug resistance gene-1 /p-glycoprotein，MDR1)和多耐药相关蛋白1(Multidrug resistance-associated protein-1，MRP1)在发育不良皮质中神经元、星形细胞、发育不良神经元和气球样细胞表达增高。多药耐药蛋白(Multidrug-resistant proteins，MDRP)可将神经系统的抗癫痫药物(AEDs)清除，因此降低了脑内有效药物浓度。然而，目前仍不清楚致痫灶中这些转运蛋白的表达增高是原发还是继发于慢性癫痫还是AEDs使用。
2.3 局灶性皮质发育不良引起的癫痫：来源于结节性硬化症的经验
结节性硬化症(Tuberous sclerosis complex，TSC)是由于mTOR调控基因TSC1或TSC2突变所致常染色体显性疾病。这种突变是皮质结节形成的典型机制，在组织学上与一些FCDs相似并且总是与难治性癫痫相关联。由于mTOR信号通路在其病理机制中的明确作用，TSC成为研究FCD癫痫发生的有价值的模型。在这种意义上，TSC2突变使谷氨酸介导的神经元兴奋性增高，且TSC患者术后切除的发育不良脑组织显示兴奋性增高。这一发现在TSC敲除小鼠进一步证实，全细胞膜片钳发现AMPA介导的兴奋性突触电流增高。另一方面，由于谷氨酸受体表达不同，异常神经元和胶质细胞比例在神经结节癫痫发生机制中发挥重要作用。因此，表达异常AMPA和NMDA受体的发育不良神经元比例高的神经结节相比主要为巨细胞或发育不良星形胶质细胞的神经结节更容易产生癫痫。
TSC痫性发作的机制与谷氨酸内环境功能失调有关。星形细胞特异性TSC1失活的小鼠表现为进展性癫痫，这可能是由于星形细胞谷氨酸转运体(GLT-1和GLAST)表达降低和通过内向整流钾通道摄取细胞外K+功能受损所致。这种与高致痫性的关系在GLT-1基因敲除小鼠中进一步证实，表明星形细胞突触谷氨酸清除受损能够增强兴奋性突触传递，进而增强了TSC的癫痫发生。
3 局灶性皮质发育不良的靶向治疗
目前FCDs的治疗仍主要为对症治疗。因为FCD引起的癫痫发作经常对AEDs耐药，所以需要癫痫手术治疗。手术切除发育不良组织可使50%～80%的患者达到癫痫缓解，与FCDs类型、年龄和切除的方式有关。但是，相当一部分患者在术后仍有发作，且一小部分患者合并术后并发症。因此，目前仍需要新的基于分子水平的治疗。
由于mTOR参与除了FCD以外的多种人类疾病，研究者不断努力探求靶向mTOR信号通路的方法。目前使用最多的抑制mTOR的药物为雷帕霉素类似物，包括雷帕霉素及其类似物西罗莫司和依维莫司。这些抑制物特异性作用于mTORC1，降低其下游效应器的生理作用，阻止异常细胞生长，突触发芽和神经元固有兴奋性增高伴mTOR信号通路激活。就这点而言，雷帕霉素慢性给药能通过阻滞突触电活动、降低AMPA受体表达及增加GABAA受体介导的神经传导，从而降低皮质兴奋性。此外，雷帕霉素也通过延长Ca2+依赖K+通道开放时间，增加皮质及海马神经元电压门控钾通道Kv1.1表达，降低神经元固有兴奋性。
雷帕霉素潜在的抗癫痫作用已经在皮质发育不良动物模型中进行评估。在灭活TSC1小鼠中，早期使用雷帕霉素能防止癫痫发作和过早死亡，而后期使用可减少癫痫发作并延长生存率。而且雷帕霉素在TSC2失活性突变小鼠中使用可改善突触可塑性和行为缺陷。在PTEN敲除小鼠中，雷帕霉素显著抑制痫性发作的严重程度和持续时间，防止神经元过度肥大并延长其存活率。雷帕霉素已成功用于mTOR相关疾病，例如，雷帕霉素能防止细胞系迁移缺损。然而这一理想的效果未在其他动物模型中观察到。例如，雷帕霉素不能减弱匹罗卡品诱导的痫性发作严重程度及频率。这表明mTOR信号通路的激活可能不是所有癫痫类型的关键机制，因此，雷帕霉素可能不产生广谱抗癫痫作用。
按照推论，mTOR抑制剂近期被用于FCDs患者中。例如，雷帕霉素的使用明显降低一例患有TSC的儿童痫性发作时间和频率，且在一个开放性研究中发现能减少TSC患者室管膜下巨大星形细胞瘤(Subependymal giant astrocytomas，SEGAs)大小。另一方面，在PMSE患者中雷帕霉素明显降低癫痫发作频率并提高接受性语言能力。然而大规模试验需评估雷帕霉素的效能和不良反应，尤其是FCDs患者。
其他的治疗方法仍处于研究阶段。例如，MDR1抑制剂(维拉帕米)在难治性癫痫患者中使用，可部分减弱癫痫发作频率和严重程度。部分FCDs患者中使用维拉帕米有利于癫痫控制。在另一方面，雷帕霉素合并RAF-MEK抑制剂可能是神经节胶质瘤的潜在治疗方法，因为这一靶向治疗和结肠癌这两条通路显著降低肿瘤细胞存活率。最近病毒感染与FCDs之间的关系为发现其他治疗方法提供新思路。总之，FCDs分子机制的新进展为精准医疗提供可能，可针对每种疾病中特定的靶向特定信号通路，离子通道，神经递质受体或转运蛋白，因而将相关副反应降至最低。
4 展望
FCDs因其可能的因果异质性，对患者神经功能的影响和缺乏精确的治疗方式仍然是临床医生的挑战。发现mTOR信号通路在FCDs和其他皮质畸形的机制中作用为有效的治疗方式提供了可能。尽管mTOR抑制剂在动物模型和患者癫痫控制中取得结果较好，目前仍需要大规模随机对照试验评估其效能和长期副反应，尤其是在FCDs患者中。并且，在FCDs脑组织切片中检测到病毒病原体有利于理解这些病变的机制，发现新的预防、诊断和治疗方法。为此，接下来的研究需证实病毒在皮质发育不良中的致病作用，并解答传播途径，流行时机和传播机制等问题。在另一方面，FCDⅠ、Ⅲ型的病因异质性提示有多种可能的致病机制。然而其解剖上和临床表现上的共同点仍难理解并成为未来需要解决的重要挑战。
