引用本文： 葛利吉, 刘宇, 黄绍平, 杨琳. 17β-雌二醇对苯巴比妥导致的未成熟脑学习记忆损伤的保护作用. 癫痫杂志, 2018, 4(1): 14-17. doi: 10.7507/2096-0247.20180004 复制
惊厥是临床常见的急症，是指脑神经元异常过度或者同步放电而产生的突发性、一过性的脑功能障碍，包括意识、运动、感觉、情感、认知等的短暂异常。流行病学研究显示，全球约有 1%～2% 的人一生中至少有一次惊厥发作。在出生后 1 岁以内，尤其新生儿时期是发病高峰，这一时期神经元对内外界环境的变化极为敏感[1, 2]。临床研究及实验室研究均发现，早期惊厥的发生是造成婴幼儿死亡的主要原因之一，同时也是引起严重的脑损伤及远期神经系统后遗症的主要原因，可能增加远期癫痫发病率[3]。目前预防及控制惊厥发作的一线用药仍为抗癫痫药物（AEDs）。AEDs 在控制惊厥发作的同时，也抑制了神经系统兴奋性，从而可能影响正常的神经系统功能[4, 5]。因此，寻找神经保护药物、减弱 AEDs 的神经毒性显得十分必要。
雌二醇（Estradiol，E2）是一种甾体激素，2009 年，Gerstner 等使用 17β-E2 保护缺血缺氧新生大鼠的脑组织，结果证实，E2 可以对少突胶质细胞起到脑保护作用，并且减轻缺血缺氧所致脑白质软化[6]。本实验给予新生大鼠腹腔注射 AEDs—苯巴比妥（Phenobarbital，PB），通过 Morris 水迷宫实验，了解短期内应用该药物是否会对未成熟脑产生远期的认知损害；同时应用 17β-E2 进行干预，了解 E2 是否具有脑保护作用，为 AEDs 使用及神经保护提供新的研究方向。
1 材料与方法
1.1 实验动物及药品
清洁级健康未成熟 Sprague Dawley（SD）窝鼠，鼠龄 3 d，由西安交通大学医学院实验动物中心提供。实验中严格遵守实验动物管理与动物保护有关规定进行饲养。12h 黑暗/光亮条件，22℃～25℃ 环境温度。PB 粉针由福建闽东力捷迅药业有限公司提供（批号 140613）；17β-E2 由美国 Sigma 公司提供（批号 069K5010V）；Morris 水迷宫（MT200USB）由西安交通大学医学院实验中心提供。实验获得医院伦理委员会批准。
1.2 方法
1.2.1 动物模型建立
30 只新生 SD 大鼠，随机分为 3 组：生理盐水对照组、PB 组和 PB+17β-E2 组，每组各 10 只大鼠。依据 Meeh-Rubner 人与大鼠间药物剂量体表面积换算公式及相关文献[7-11]来确定用药剂量，分别是：生理盐水 10 mL/（kg·d），PB 62.5 mg/（kg·d）［相当于临床抢救剂量 10 mg/（kg·d）］，17β-E2 300 ug/（kg·d）。
1.2.2 实验装备情况
Morris 水迷宫跟踪系统包括一个圆形乳白色水池，直径 120 cm，高 50 cm；池壁上标有N、S、W和E 4 个入水点，将水池等分为 4 个象限；目标象限的固定位置放一直径 9 cm、高 27 cm 的圆形乳白色平台，水面高于平台 1.5 cm，整个实验期间平台位置保持不变；水中加 1kg 奶粉，温水冲开，以隐藏平台，水温保持在（22.0±0.5）℃，用苦味酸在实验动物的头部和背部涂成较大相连的区域，便于摄像；实验期间迷宫外有足够的参照物，且始终保持不变。迷宫上方安置带有显示系统的摄像机，同步记录动物游泳轨迹，Morris 水迷宫数据采集和分析软件记录相关数据及图像结果。
1.2.3 水迷宫行为测试
测试包括定位航行试验和空间探索试验两个部分。在正式 Moriss 水迷宫测试前 1 d，将实验大鼠带入实验室熟悉环境，并将大鼠放入水中 120 s 进行适应性训练。
① 定位航行试验：用于检测大鼠在水迷宫训练中对空间线索的学习和记忆能力。第 30 天正式实验，每只大鼠每天训练 8 次，上午 4 次，下午 4 次，连续 4 d。测试大鼠面向池壁没入水中，其入水点在 N、S、E 和 W 中随机选取。记录大鼠游上平台所需时间（即潜伏期）。每次大鼠游上平台，待其在平台上停留 30 s 后取出动物，再进行下一只实验。若潜伏期超过 120 s，用硬尺将大鼠引导至平台并停留 30 s，且该次测验的潜伏期记录为 120 s。取 8 次逃避潜伏期平均值为每天的逃避潜伏期。
② 空间探索实验：用于测试大鼠学会寻找平台后，对平台空间位置的记忆能力。于第 5 天上午撤除平台，将大鼠头向平台对侧象限宫壁的中点放入水中，记录大鼠 120 s 内穿过原平台位置的次数。和在原平台象限探索时间与总时间（120 s）的百分比，原平台象限与 120 s 内游泳总路程之比，以此评价动物对已获取信息的存储、记忆能力。
1.3 统计学方法
采用 SPSS20.0 统计软件进行处理。数据采用均数±标准差表示，采用 t 检验和方差分析，P 值<0.05 为差异具有统计学意义。
2 结果
2.1 苯巴比妥组
从图 1 可以看出，各组大鼠寻找平台的潜伏期随着实验进行逐日递减，从第 3 天开始潜伏期趋于平稳，选取第 4 天数据进行统计：PB 组大鼠较对照组大鼠寻找水下平台的潜伏期明显延长，存在显著差异性（P<0.01）。穿越有效区次数，与对照组比较明显减少，存在统计学差异（P<0.05）。120 s 内平台象限路程与总路程之比低于对照组，但无统计学意义（表 1）。
2.2 苯巴比妥+17β-雌二醇组
PB+17β-E2 组大鼠较 PB 组寻找水下平台潜伏期缩短，组间比较存在统计学差异（P<0.01）。穿越有效区次数较 PB 组明显增多，有统计学意义（P<0.05）。120 s 内平台象限路程与总路程之比高于 PB 组，但无统计学意义。PB+17β-E2 组与对照组比较以上各指标无明显差异，见表 1。
图1
各组大鼠每日平均潜伏期（s）
Figure1.
The average latent periods (s) of rats
表1
各组大鼠 Morris 水迷宫实验结果的比较（
）
Table1.
Comparison of Morris experiment between each group
3 讨论
婴幼儿期是惊厥发生的高风险时期，有报道称[12, 13]在美国新生儿惊厥的发生率为 0.18%～0.35%，早产儿更高。临床及动物研究均已证实[1, 14-17]，严重或反复地惊厥发作会导致惊厥性脑损伤，大部分专家主张对新生儿惊厥采取积极药物治疗。然而，目前各国用于婴幼儿惊厥的一线药物仍是 AEDs，其中，PB 更是最常被列为首选用药[18, 19]。本实验以出生 3 d 的 SD 大鼠模拟婴幼儿，给予临床抢救剂量的 PB，观察 PB 是否会对未成熟脑远期学习记忆产生行为学上的损害。
已有研究证明，17β-E2 对缺血性脑损伤具有神经保护作用，17β-E2 神经保护作用机制包括受体依赖机制和非受体依赖机制[20]，与靶器官中的雌激素受体结合是 17β-E2 在体内最主要的作用途径。研究证明，17β-E2 作为新生儿尤其是早产儿缺血缺氧的保护剂，可以作用于少突胶质细胞，减轻缺血缺氧导致的脑白质病变[21]。但是国内外有关 E2 对未成熟脑使用 PB 的保护研究较少。我们给予未成熟脑短疗程 PB 的同时加用 E2 保护，水迷宫实验中发现与 PB 组比较，大鼠平均逃避潜伏期缩短，穿越平台象限次数增加。证明 E2 对未成熟脑使用 PB 物造成的脑损伤具有保护作用。
由于婴幼儿处在特定的年龄阶段，各系统发育尚未成熟，药代动力学参数也不稳定，因此，药物安全性显得更为重要。同时，安全性又是神经保护药物的首要条件之一。17β-E2 在临床已经有广泛应用，在婴幼儿神经保护方面的安全性也得到了动物实验的证实。在儿科临床领域，17β-E2 在早产儿骨代谢异常中已经得到应用，并且目前尚无不良反应报告，因此，临床应用具有很高的安全性[12]。
在该实验中，我们对出生后 3 d 的 SD 大鼠腹腔注射 17β-E2，并未发现动物明显的不良反应，提示该药具有较高的安全性。因此，在 PB 临床应用中，辅助使用 17β-E2 以保护未成熟脑神经发育的可行性仍值得进一步探讨。
惊厥是临床常见的急症，是指脑神经元异常过度或者同步放电而产生的突发性、一过性的脑功能障碍，包括意识、运动、感觉、情感、认知等的短暂异常。流行病学研究显示，全球约有 1%～2% 的人一生中至少有一次惊厥发作。在出生后 1 岁以内，尤其新生儿时期是发病高峰，这一时期神经元对内外界环境的变化极为敏感[1, 2]。临床研究及实验室研究均发现，早期惊厥的发生是造成婴幼儿死亡的主要原因之一，同时也是引起严重的脑损伤及远期神经系统后遗症的主要原因，可能增加远期癫痫发病率[3]。目前预防及控制惊厥发作的一线用药仍为抗癫痫药物（AEDs）。AEDs 在控制惊厥发作的同时，也抑制了神经系统兴奋性，从而可能影响正常的神经系统功能[4, 5]。因此，寻找神经保护药物、减弱 AEDs 的神经毒性显得十分必要。
雌二醇（Estradiol，E2）是一种甾体激素，2009 年，Gerstner 等使用 17β-E2 保护缺血缺氧新生大鼠的脑组织，结果证实，E2 可以对少突胶质细胞起到脑保护作用，并且减轻缺血缺氧所致脑白质软化[6]。本实验给予新生大鼠腹腔注射 AEDs—苯巴比妥（Phenobarbital，PB），通过 Morris 水迷宫实验，了解短期内应用该药物是否会对未成熟脑产生远期的认知损害；同时应用 17β-E2 进行干预，了解 E2 是否具有脑保护作用，为 AEDs 使用及神经保护提供新的研究方向。
1 材料与方法
1.1 实验动物及药品
清洁级健康未成熟 Sprague Dawley（SD）窝鼠，鼠龄 3 d，由西安交通大学医学院实验动物中心提供。实验中严格遵守实验动物管理与动物保护有关规定进行饲养。12h 黑暗/光亮条件，22℃～25℃ 环境温度。PB 粉针由福建闽东力捷迅药业有限公司提供（批号 140613）；17β-E2 由美国 Sigma 公司提供（批号 069K5010V）；Morris 水迷宫（MT200USB）由西安交通大学医学院实验中心提供。实验获得医院伦理委员会批准。
1.2 方法
1.2.1 动物模型建立
30 只新生 SD 大鼠，随机分为 3 组：生理盐水对照组、PB 组和 PB+17β-E2 组，每组各 10 只大鼠。依据 Meeh-Rubner 人与大鼠间药物剂量体表面积换算公式及相关文献[7-11]来确定用药剂量，分别是：生理盐水 10 mL/（kg·d），PB 62.5 mg/（kg·d）［相当于临床抢救剂量 10 mg/（kg·d）］，17β-E2 300 ug/（kg·d）。
1.2.2 实验装备情况
Morris 水迷宫跟踪系统包括一个圆形乳白色水池，直径 120 cm，高 50 cm；池壁上标有N、S、W和E 4 个入水点，将水池等分为 4 个象限；目标象限的固定位置放一直径 9 cm、高 27 cm 的圆形乳白色平台，水面高于平台 1.5 cm，整个实验期间平台位置保持不变；水中加 1kg 奶粉，温水冲开，以隐藏平台，水温保持在（22.0±0.5）℃，用苦味酸在实验动物的头部和背部涂成较大相连的区域，便于摄像；实验期间迷宫外有足够的参照物，且始终保持不变。迷宫上方安置带有显示系统的摄像机，同步记录动物游泳轨迹，Morris 水迷宫数据采集和分析软件记录相关数据及图像结果。
1.2.3 水迷宫行为测试
测试包括定位航行试验和空间探索试验两个部分。在正式 Moriss 水迷宫测试前 1 d，将实验大鼠带入实验室熟悉环境，并将大鼠放入水中 120 s 进行适应性训练。
① 定位航行试验：用于检测大鼠在水迷宫训练中对空间线索的学习和记忆能力。第 30 天正式实验，每只大鼠每天训练 8 次，上午 4 次，下午 4 次，连续 4 d。测试大鼠面向池壁没入水中，其入水点在 N、S、E 和 W 中随机选取。记录大鼠游上平台所需时间（即潜伏期）。每次大鼠游上平台，待其在平台上停留 30 s 后取出动物，再进行下一只实验。若潜伏期超过 120 s，用硬尺将大鼠引导至平台并停留 30 s，且该次测验的潜伏期记录为 120 s。取 8 次逃避潜伏期平均值为每天的逃避潜伏期。
② 空间探索实验：用于测试大鼠学会寻找平台后，对平台空间位置的记忆能力。于第 5 天上午撤除平台，将大鼠头向平台对侧象限宫壁的中点放入水中，记录大鼠 120 s 内穿过原平台位置的次数。和在原平台象限探索时间与总时间（120 s）的百分比，原平台象限与 120 s 内游泳总路程之比，以此评价动物对已获取信息的存储、记忆能力。
1.3 统计学方法
采用 SPSS20.0 统计软件进行处理。数据采用均数±标准差表示，采用 t 检验和方差分析，P 值<0.05 为差异具有统计学意义。
2 结果
2.1 苯巴比妥组
从图 1 可以看出，各组大鼠寻找平台的潜伏期随着实验进行逐日递减，从第 3 天开始潜伏期趋于平稳，选取第 4 天数据进行统计：PB 组大鼠较对照组大鼠寻找水下平台的潜伏期明显延长，存在显著差异性（P<0.01）。穿越有效区次数，与对照组比较明显减少，存在统计学差异（P<0.05）。120 s 内平台象限路程与总路程之比低于对照组，但无统计学意义（表 1）。
2.2 苯巴比妥+17β-雌二醇组
PB+17β-E2 组大鼠较 PB 组寻找水下平台潜伏期缩短，组间比较存在统计学差异（P<0.01）。穿越有效区次数较 PB 组明显增多，有统计学意义（P<0.05）。120 s 内平台象限路程与总路程之比高于 PB 组，但无统计学意义。PB+17β-E2 组与对照组比较以上各指标无明显差异，见表 1。
图1
各组大鼠每日平均潜伏期（s）
Figure1.
The average latent periods (s) of rats
表1
各组大鼠 Morris 水迷宫实验结果的比较（
）
Table1.
Comparison of Morris experiment between each group
3 讨论
婴幼儿期是惊厥发生的高风险时期，有报道称[12, 13]在美国新生儿惊厥的发生率为 0.18%～0.35%，早产儿更高。临床及动物研究均已证实[1, 14-17]，严重或反复地惊厥发作会导致惊厥性脑损伤，大部分专家主张对新生儿惊厥采取积极药物治疗。然而，目前各国用于婴幼儿惊厥的一线药物仍是 AEDs，其中，PB 更是最常被列为首选用药[18, 19]。本实验以出生 3 d 的 SD 大鼠模拟婴幼儿，给予临床抢救剂量的 PB，观察 PB 是否会对未成熟脑远期学习记忆产生行为学上的损害。
已有研究证明，17β-E2 对缺血性脑损伤具有神经保护作用，17β-E2 神经保护作用机制包括受体依赖机制和非受体依赖机制[20]，与靶器官中的雌激素受体结合是 17β-E2 在体内最主要的作用途径。研究证明，17β-E2 作为新生儿尤其是早产儿缺血缺氧的保护剂，可以作用于少突胶质细胞，减轻缺血缺氧导致的脑白质病变[21]。但是国内外有关 E2 对未成熟脑使用 PB 的保护研究较少。我们给予未成熟脑短疗程 PB 的同时加用 E2 保护，水迷宫实验中发现与 PB 组比较，大鼠平均逃避潜伏期缩短，穿越平台象限次数增加。证明 E2 对未成熟脑使用 PB 物造成的脑损伤具有保护作用。
由于婴幼儿处在特定的年龄阶段，各系统发育尚未成熟，药代动力学参数也不稳定，因此，药物安全性显得更为重要。同时，安全性又是神经保护药物的首要条件之一。17β-E2 在临床已经有广泛应用，在婴幼儿神经保护方面的安全性也得到了动物实验的证实。在儿科临床领域，17β-E2 在早产儿骨代谢异常中已经得到应用，并且目前尚无不良反应报告，因此，临床应用具有很高的安全性[12]。
在该实验中，我们对出生后 3 d 的 SD 大鼠腹腔注射 17β-E2，并未发现动物明显的不良反应，提示该药具有较高的安全性。因此，在 PB 临床应用中，辅助使用 17β-E2 以保护未成熟脑神经发育的可行性仍值得进一步探讨。
