引用本文： 方子妍, 吴逢春, 陈树达, 秦家明, 宁玉萍, 周列民. 苯妥英钠耐药性颞叶内侧癫痫大鼠模型的构建. 癫痫杂志, 2019, 5(1): 21-25. doi: 10.7507/2096-0247.20190004 复制
尽管近年来癫痫在治疗上已取得了长足的进步，但合理、规则地服用抗癫痫药物（AEDs）仍是癫痫治疗的主要手段。虽经正规 AEDs 治疗，仍有约 30% 癫痫患者发作无法控制，即耐药性癫痫[1, 2]。临床上耐药性癫痫以颞叶内侧癫痫（Mesial temporal lobe epilepsy，MTLE）尤为多见。
虽然癫痫耐药机制有多种假说，但耐药性癫痫具有对多种 AEDs 均产生耐药的特点，即使这些 AEDs 具有不同的作用机制[3]。这一现象可由多药转运体过表达学说解释，即脑中 P 糖蛋白的过表达导致了药物耐受[4, 5]，也是近年来耐药性癫痫方向的研究热点。手术切除耐药性癫痫患者的脑组织上可见 P 糖蛋白（多药转运体之一）过表达，而现有的多种传统的或新型 AEDs 都是 P 糖蛋白的作用底物[6]，因此推测脑中 P 糖蛋白过表达阻碍了 AEDs 进入癫痫灶的剂量，导致癫痫发作控制不佳，从而产生 AEDs 耐受现象。但由于伦理问题，无法比较不耐药性癫痫患者脑中 P 糖蛋白表达水平的差异，因此耐药性癫痫动物模型是目前耐药性癫痫研究领域用于筛选新型 AEDs 疗效判断的最佳选择。
研究证明，慢性 MTLE 动物模型通过 AEDs 耐药筛选出不耐药和耐药两个亚组，可作为研究两亚组动物模型脑中 P 糖蛋白表达差异的合适研究对象。例如，对杏仁核电点燃大鼠模型予最大耐受剂量的苯巴比妥治疗，根据其对苯巴比妥治疗的效果可将其分成是否耐药两个亚组，并证实耐药性模型鼠脑中 P 糖蛋白表达显著高于不耐药性模型鼠[7]。但无直接证据证实癫痫灶的 AEDs 浓度降低是由于局部脑组织中多药转运体过表达从而降低 AEDs 进入脑中的浓度，导致模型动物癫痫发作控制不佳。因此，本研究通过在锂-匹罗卡品化学诱导的慢性 MTLE 模型大鼠上，经过苯妥英钠筛选出耐药及不耐药模型鼠，采用活体微透析脑局部取样技术直接检测比较筛选出的耐药性模型大鼠与不耐药性模型大鼠脑中 AEDs 浓度的差异进一步验证。
1 材料与方法
1.1 实验动物、试剂与仪器
1.1.1 动物来源
雌性 6～8 周 SD 大鼠 30 只，体重 160～180 g（广东省实验动物研究所）。
1.1.2 主要试剂
氯化锂（Sigma L9650-100G）；匹罗卡品（Sigma P6503-10G）；东莨菪碱（Sigma S8502-1G）；苯妥英钠（Sigma）。
1.1.3 主要仪器设备
微量进样泵（MD-1020，Bioanalytical Systems Inc，USA）；微量收集器（MD-1027，Bioanalytical Systems Inc，USA）；液相色谱输液泵（Waters Model 510 Millipore HPLC Pump）；进样器（Waters 717 plus Autosampler）；检测器（Waters 486 Tunable Absorbance Detector）；数据采集软件（Empower）。
1.2 锂-匹罗卡品化学诱导构建耐药性 MTLE 模型大鼠
1.2.1 锂-匹罗卡品构建慢性 MTLE 模型大鼠
1.2.2 苯妥英钠筛选耐药性及不耐药性 MTLE 模型大鼠
采用视频脑电图（VEEG）进行连续监测，分为 3 个时期（基线期，即癫痫持续状态后慢性期第 46～60 天；苯妥英钠筛选期，即持续状态后慢性期第 61～75 天；苯妥英钠洗脱期，即持续状态后慢性期第 76～90 天）。根据苯妥英钠给药前后癫痫频次变化筛选出苯妥英钠耐药性模型（筛选期发作频次较基线期降低<50%），余为苯妥英钠不耐药模型鼠。筛选期予以苯妥英钠腹腔注射 35 mg/kg（2 次/ d，连续 2 周），于筛选期第 2、8、15 天清晨给药前，眼底静脉丛采血收集新鲜血 300 uL，4℃ 12 000 rmp 离心 4 min，采集上层血清 –20℃ 冰箱保存，待测浓度。基线期及洗脱期均于相同时间段腹腔注射同体积的生理盐水替代药物。
1.2.3 苯妥英钠耐药性及不耐药性模型大鼠脑中药物浓度检测
苯妥英钠洗脱期后，模型大鼠颈静脉置管后固定在立体定位仪[8, 9]，定位于前囟后 5.2 mm，左 5.0 mm，微透析探针置入深度为前囟以下 7.5 mm。探针置入后稳定 2 h 才开始给药（苯妥英钠，35 mg/kg，2 mL/kg，静脉注射）。给药后 30、60、120、180、240 和 300 min，取全血 300 μL，4℃ 12 000rpm 离心 4 min 取上清液 –20℃ 保存。同时收集 0～30、30～60、60～120、120～180、180～240 和 240～300 min 的微透析液，–20℃ 保存。微透析实验后，大鼠断头取脑，免疫组织化学检测 P 糖蛋白表达。苯妥英钠在脑中的分布用脑/血浆的时间药物浓度曲线的曲线下面积比值进行量化。高效液相色谱法检测待测样品中苯妥英钠浓度[10]。
1.2.4 苯妥英钠耐药性及不耐药性模型大鼠脑中 P 糖蛋白检测
采用单克隆小鼠抗大鼠 Mdr C-19 抗体（sc-1517，Santa Cruz Biotechnology，USA），具体步骤参见前期研究结果[8, 9, 11]。
1.3 统计学方法
用 SPSS 21.0 统计软件进行数据处理。计量资料以均数±标准差或中位值（四分位间距）表示，t 检验（或 Wilcoxon 秩和检验）和 One-way ANOVA（或 Kruskal Wallis 秩和检验）进行数据比较。以 P 值 <0.05 为差异具有统计学意义。
2 结果
30 只大鼠中成功构建为慢性 MTLE 模型 16 只，成功筛选出耐药模型大鼠 6 只（6/16）。
2.1 锂-匹罗卡品构建慢性 MTLE 模型鼠
急性期：腹腔注射匹罗卡品至大鼠出现持续状态的时间为（50.2±26.6） min，匹罗卡品用药剂量为（42.6±13.4） mg/kg，发作程度分级达到 Racine 分级[12]Ⅳ级或以上视为急性期造模成功。有 5 只大鼠给药后没有出现发作；25 只大鼠出现发作中仅有 21 只发作程度达到 Racine 分级 IV 级及以上，其中 1 只大鼠在 SE 过程中死亡。锂-匹罗卡品化学诱导大鼠急性期出现持续状态的成功率为 66.7%（20/30）。大鼠在注射锂-匹罗卡品后急性期出现以下不同程度的表现，包括：少动、盯视、嘴部自动症、点头、眨眼及湿狗样晃动；随后出现瞬时性惊厥发作：表现为直立、前肢和头部阵挛、下肢强直，随后摔倒，达到 Racine 分级Ⅳ/Ⅴ标准，并形成惊厥持续状态持续 90 min。
慢性期：有 20 只大鼠持续状态后经过 1～3 周潜伏期过渡到慢性期，2 只大鼠在饲养过程中死亡，2 只大鼠未出现慢性期发作，建模成功率为 53.3%（16/30），其发作表现为咀嚼、盯视等动作，每次持续数秒至十余秒，有时则泛化为全身性发作，符合临床 MTLE 患者类似的行为学表现，并根据 Racine 分级记录发作程度，发作期 EEG 记录可见痫性放电（图 1a）。与正常对照鼠（10 只）相比，具有癫痫发作的模型鼠于慢性期均出现海马硬化的病理改变（正常大鼠海马 CA3 区神经元形态见图 1b，MTLE 模型鼠海马 CA3 区神经元形态见图 1c）。
图1
锂-匹罗卡品构建的慢性颞叶内侧癫痫模型大鼠的海马神经元形态及发作期脑电图改变
a. 慢性颞叶内侧癫痫模型大鼠脑电图；b. 正常大鼠海马 CA3 区神经元形态（尼氏染色 ×400）；c. 慢性颞叶内侧癫痫模型大鼠海马 CA3 区神经元形态（尼氏染色 ×400）
Figure1. Nissl’s staining in hippocampus CA3 and EEG in epileptic stage of MTLE rat model induced by Li-pilocarpinea. EEG in epileptic stage of MTLE rat model; b. the morphology of neurons in hippocampus CA3 of normal rat (Nissl’s staing ×400); c. the morphology of neurons in hippocampus CA3 of MTLE rat model (Nissl’s staing ×400)
2.2 苯妥英钠筛选耐药性及不耐药性 MTLE 模型鼠
苯妥英钠血药浓度：筛选期第 2、8、15 天，耐药性及不耐药性模型大鼠两组之间苯妥英钠血药浓度均无统计学差异（P>0.05）。两组苯妥英钠血药浓度于第 2、8、15 天之间也均无统计学差异（P>0.05）。
苯妥英钠疗效筛选分组：16 只具有发作的模型鼠中筛选出耐药性模型鼠 6 只，另 10 只为不耐药性模型鼠。苯妥英钠筛选期时，10 只不耐药性模型鼠中有 2 只模型鼠完全无发作，8 只发作频次相较于基线期降低>50%。6 只耐药性模型鼠发作频次不但没有降低，反而比基线期发作频次增高；在不耐药性模型鼠中，苯妥英钠筛选期较基线期及苯妥英钠洗脱期癫痫发作频次有明显降低（P<0.05）；在耐药性模型鼠中，苯妥英钠筛选期较基线期及苯妥英钠洗脱期癫痫发作频次无降低，反而稍有增高，差异无统计学意义（P>0.05），见表 1。
表1
耐药性及不耐药性颞叶内侧癫痫模型大鼠不同时期的癫痫发作频次比较（
）
Table1.
Comparison of seizures frequency of drug-resistant and drug-responsive MTLE rat model during different periods (
)
2.3 耐药性及不耐药性 MTLE 模型大鼠脑中药物浓度
脑微透析液药物浓度：不耐药性模型大鼠与耐药模型大鼠予一次性给药苯妥英钠后 30、60、120、180、240 及 300 min，脑中药物浓度均有统计学差异，耐药模性型鼠低于不耐药性模型鼠（P<0.05），图 2。
图2
耐药性及不耐药性颞叶内侧癫痫模型大鼠脑中苯妥英钠浓度比较
Figure2.
Comparison of phenytoin level in brain of drug-resistant and drug-responsive MTLE rat model
血浆药物浓度：不耐药性模型鼠与耐药性模型大鼠于一次性给药 PHT 后 30、60、120、180、240 及 300 min，外周血中药物浓度均无统计学差异（P>0.05），图 3。
图3
耐药性及不耐药性颞叶内侧癫痫模型大鼠血中苯妥英钠浓度比较
Figure3.
Comparison of phenytoin level in plasma of drug-resistant and drug-responsive MTLE rat model
脑/血浆的时间药物浓度曲线的曲线下面积比值：不耐药性与耐药性模型大鼠的脑/血浆的时间药物浓度曲线的曲线下面积比值之间有统计学差异，耐药性模型鼠明显低于不耐药性模型鼠（0.15±0.03 vs. 0.28±0.05，P<0.05），图 4。
图4
耐药性及不耐药性颞叶内侧癫痫模型大鼠脑中苯妥英钠分布比较
Figure4.
Comparison of phenytoin distribution in brain of drug-resistant and drug-responsive MTLE rat model
2.4 耐药性及不耐药性 MTLE 模型大鼠脑中 P 糖蛋白表达
相较于正常对照大鼠，MTLE 模型鼠海马各区的 P 糖蛋白的表达均明显增高；相较于不耐药模型鼠，耐药性模型鼠海马各区的 P 糖蛋白表达均显著增高（P<0.05）。
3 讨论
建立慢性癫痫动物模型的主要目的是利用模型来探索人类癫痫发作，尤其是耐药性癫痫发作的成因及演变规律。而理想的耐药性癫痫动物模型除应具备慢性、自发性、复发性这 3 个共同特征外，还应具备以下特征：模型的痫性发作应与人类癫痫的临床表现相似；模型的痫性发作应与 EEG 的改变相对应，以便从行为和 EEG 改变两个方面评估 AEDs 的作用效果；标准的 AEDs 不能或只能微弱的控制慢性自主发作；模型应满足进行长期 AEDs 的药效研究，即动物可伴随癫痫发作长期存活，且治疗过程中能保持有效的药物浓度[13]。
目前癫痫动物模型主要有遗传模型和点燃模型，而遗传模型因制作复杂和费用昂贵，且特异性太强，不适合广泛应用，因此目前应用最多的是点燃模型，即化学点燃模型和电点燃模型。电点燃模型由于构建相对快捷，但是其自然发生发展进程与人类 MTLE 病程相悖，并不是适合的模型。我们的研究采用锂-匹罗卡品化学诱导模型早期出现惊厥样发作，经一段潜伏期后慢性期出现自发性反复发作，慢性期的发作在行为学上类似于人类 MTLE 复杂部分性癫痫发作和/或伴继发性全身强直阵挛发作，其同步 EEG 也类似于人类。发生发展进程与人类 MTLE 病程相似[14]。另外，由于锂-匹罗卡品联合使用而毒性作用小，慢性自主发作期持续时间较长，大鼠可长期存活。本课题组前期研究发现锂-匹罗卡品注射致惊厥持续状态后 60 天海马 CA1、CA3 及 DG 区锥体细胞层见部分细胞肿胀、破裂，细胞轮廓模糊、界限不清，呈空泡样变性，胞浆尼氏小体减少，出现神经元的缺失，再次证实了该模型的病理学特点，与人类 MTLE 病理改变一致[15]。因此，该模型无论临床特征还是病理改变均很好的模拟了人类 MTLE。
在此基础上，我们进一步对该模型进行了耐药性的筛查和机制验证。鉴于模型大鼠慢性期自发性反复发作具有波动性和呈簇性出现。因此，非给药期及给药期的持续 VEEG 监测对于完整的准确的评估是必不可少的。另外，我们在设置了基线期和筛选期的基础上还增加了苯妥英钠洗脱期，形成自身对照，以证实模型大鼠发作频次变化与苯妥英钠治疗具有明显的相关性。
该研究中，30 只大鼠中 16 只在癫痫持续状态后慢性期出现自发性反复发作，造模成功率为 53.3%（16/30），其中有 6 只对最大耐受剂量的苯妥英钠给药无效，这一比例与既往报道的研究所筛选的结果是一致的；另 10 只发作频次降低至少有 50%，达到临床上判断药物治疗有效的标准。10 只不耐药性模型鼠中有 2 只在筛选期出现完全无发作。在此期间，不耐药与耐药组之间癫痫发作频次有明显差别，而基线期并无统计学差异。因此我们认为，利用苯妥英钠筛选锂-匹罗卡品诱导持续状态后慢性期具有自发性反复发作的 MTLE 模型大鼠中的不耐药性与耐药性模型的方式是可行的。
综上，以锂-匹罗卡品诱导的 MTLE 大鼠模型为基础，应用苯妥英钠筛选出的耐药性癫痫模型大鼠脑中苯妥英钠药物浓度下降，可作为研究该耐药性机制及药物筛选的理想模型进行后续研究。
尽管近年来癫痫在治疗上已取得了长足的进步，但合理、规则地服用抗癫痫药物（AEDs）仍是癫痫治疗的主要手段。虽经正规 AEDs 治疗，仍有约 30% 癫痫患者发作无法控制，即耐药性癫痫[1, 2]。临床上耐药性癫痫以颞叶内侧癫痫（Mesial temporal lobe epilepsy，MTLE）尤为多见。
虽然癫痫耐药机制有多种假说，但耐药性癫痫具有对多种 AEDs 均产生耐药的特点，即使这些 AEDs 具有不同的作用机制[3]。这一现象可由多药转运体过表达学说解释，即脑中 P 糖蛋白的过表达导致了药物耐受[4, 5]，也是近年来耐药性癫痫方向的研究热点。手术切除耐药性癫痫患者的脑组织上可见 P 糖蛋白（多药转运体之一）过表达，而现有的多种传统的或新型 AEDs 都是 P 糖蛋白的作用底物[6]，因此推测脑中 P 糖蛋白过表达阻碍了 AEDs 进入癫痫灶的剂量，导致癫痫发作控制不佳，从而产生 AEDs 耐受现象。但由于伦理问题，无法比较不耐药性癫痫患者脑中 P 糖蛋白表达水平的差异，因此耐药性癫痫动物模型是目前耐药性癫痫研究领域用于筛选新型 AEDs 疗效判断的最佳选择。
研究证明，慢性 MTLE 动物模型通过 AEDs 耐药筛选出不耐药和耐药两个亚组，可作为研究两亚组动物模型脑中 P 糖蛋白表达差异的合适研究对象。例如，对杏仁核电点燃大鼠模型予最大耐受剂量的苯巴比妥治疗，根据其对苯巴比妥治疗的效果可将其分成是否耐药两个亚组，并证实耐药性模型鼠脑中 P 糖蛋白表达显著高于不耐药性模型鼠[7]。但无直接证据证实癫痫灶的 AEDs 浓度降低是由于局部脑组织中多药转运体过表达从而降低 AEDs 进入脑中的浓度，导致模型动物癫痫发作控制不佳。因此，本研究通过在锂-匹罗卡品化学诱导的慢性 MTLE 模型大鼠上，经过苯妥英钠筛选出耐药及不耐药模型鼠，采用活体微透析脑局部取样技术直接检测比较筛选出的耐药性模型大鼠与不耐药性模型大鼠脑中 AEDs 浓度的差异进一步验证。
1 材料与方法
1.1 实验动物、试剂与仪器
1.1.1 动物来源
雌性 6～8 周 SD 大鼠 30 只，体重 160～180 g（广东省实验动物研究所）。
1.1.2 主要试剂
氯化锂（Sigma L9650-100G）；匹罗卡品（Sigma P6503-10G）；东莨菪碱（Sigma S8502-1G）；苯妥英钠（Sigma）。
1.1.3 主要仪器设备
微量进样泵（MD-1020，Bioanalytical Systems Inc，USA）；微量收集器（MD-1027，Bioanalytical Systems Inc，USA）；液相色谱输液泵（Waters Model 510 Millipore HPLC Pump）；进样器（Waters 717 plus Autosampler）；检测器（Waters 486 Tunable Absorbance Detector）；数据采集软件（Empower）。
1.2 锂-匹罗卡品化学诱导构建耐药性 MTLE 模型大鼠
1.2.1 锂-匹罗卡品构建慢性 MTLE 模型大鼠
1.2.2 苯妥英钠筛选耐药性及不耐药性 MTLE 模型大鼠
采用视频脑电图（VEEG）进行连续监测，分为 3 个时期（基线期，即癫痫持续状态后慢性期第 46～60 天；苯妥英钠筛选期，即持续状态后慢性期第 61～75 天；苯妥英钠洗脱期，即持续状态后慢性期第 76～90 天）。根据苯妥英钠给药前后癫痫频次变化筛选出苯妥英钠耐药性模型（筛选期发作频次较基线期降低<50%），余为苯妥英钠不耐药模型鼠。筛选期予以苯妥英钠腹腔注射 35 mg/kg（2 次/ d，连续 2 周），于筛选期第 2、8、15 天清晨给药前，眼底静脉丛采血收集新鲜血 300 uL，4℃ 12 000 rmp 离心 4 min，采集上层血清 –20℃ 冰箱保存，待测浓度。基线期及洗脱期均于相同时间段腹腔注射同体积的生理盐水替代药物。
1.2.3 苯妥英钠耐药性及不耐药性模型大鼠脑中药物浓度检测
苯妥英钠洗脱期后，模型大鼠颈静脉置管后固定在立体定位仪[8, 9]，定位于前囟后 5.2 mm，左 5.0 mm，微透析探针置入深度为前囟以下 7.5 mm。探针置入后稳定 2 h 才开始给药（苯妥英钠，35 mg/kg，2 mL/kg，静脉注射）。给药后 30、60、120、180、240 和 300 min，取全血 300 μL，4℃ 12 000rpm 离心 4 min 取上清液 –20℃ 保存。同时收集 0～30、30～60、60～120、120～180、180～240 和 240～300 min 的微透析液，–20℃ 保存。微透析实验后，大鼠断头取脑，免疫组织化学检测 P 糖蛋白表达。苯妥英钠在脑中的分布用脑/血浆的时间药物浓度曲线的曲线下面积比值进行量化。高效液相色谱法检测待测样品中苯妥英钠浓度[10]。
1.2.4 苯妥英钠耐药性及不耐药性模型大鼠脑中 P 糖蛋白检测
采用单克隆小鼠抗大鼠 Mdr C-19 抗体（sc-1517，Santa Cruz Biotechnology，USA），具体步骤参见前期研究结果[8, 9, 11]。
1.3 统计学方法
用 SPSS 21.0 统计软件进行数据处理。计量资料以均数±标准差或中位值（四分位间距）表示，t 检验（或 Wilcoxon 秩和检验）和 One-way ANOVA（或 Kruskal Wallis 秩和检验）进行数据比较。以 P 值 <0.05 为差异具有统计学意义。
2 结果
30 只大鼠中成功构建为慢性 MTLE 模型 16 只，成功筛选出耐药模型大鼠 6 只（6/16）。
2.1 锂-匹罗卡品构建慢性 MTLE 模型鼠
急性期：腹腔注射匹罗卡品至大鼠出现持续状态的时间为（50.2±26.6） min，匹罗卡品用药剂量为（42.6±13.4） mg/kg，发作程度分级达到 Racine 分级[12]Ⅳ级或以上视为急性期造模成功。有 5 只大鼠给药后没有出现发作；25 只大鼠出现发作中仅有 21 只发作程度达到 Racine 分级 IV 级及以上，其中 1 只大鼠在 SE 过程中死亡。锂-匹罗卡品化学诱导大鼠急性期出现持续状态的成功率为 66.7%（20/30）。大鼠在注射锂-匹罗卡品后急性期出现以下不同程度的表现，包括：少动、盯视、嘴部自动症、点头、眨眼及湿狗样晃动；随后出现瞬时性惊厥发作：表现为直立、前肢和头部阵挛、下肢强直，随后摔倒，达到 Racine 分级Ⅳ/Ⅴ标准，并形成惊厥持续状态持续 90 min。
慢性期：有 20 只大鼠持续状态后经过 1～3 周潜伏期过渡到慢性期，2 只大鼠在饲养过程中死亡，2 只大鼠未出现慢性期发作，建模成功率为 53.3%（16/30），其发作表现为咀嚼、盯视等动作，每次持续数秒至十余秒，有时则泛化为全身性发作，符合临床 MTLE 患者类似的行为学表现，并根据 Racine 分级记录发作程度，发作期 EEG 记录可见痫性放电（图 1a）。与正常对照鼠（10 只）相比，具有癫痫发作的模型鼠于慢性期均出现海马硬化的病理改变（正常大鼠海马 CA3 区神经元形态见图 1b，MTLE 模型鼠海马 CA3 区神经元形态见图 1c）。
图1
锂-匹罗卡品构建的慢性颞叶内侧癫痫模型大鼠的海马神经元形态及发作期脑电图改变
a. 慢性颞叶内侧癫痫模型大鼠脑电图；b. 正常大鼠海马 CA3 区神经元形态（尼氏染色 ×400）；c. 慢性颞叶内侧癫痫模型大鼠海马 CA3 区神经元形态（尼氏染色 ×400）
Figure1. Nissl’s staining in hippocampus CA3 and EEG in epileptic stage of MTLE rat model induced by Li-pilocarpinea. EEG in epileptic stage of MTLE rat model; b. the morphology of neurons in hippocampus CA3 of normal rat (Nissl’s staing ×400); c. the morphology of neurons in hippocampus CA3 of MTLE rat model (Nissl’s staing ×400)
2.2 苯妥英钠筛选耐药性及不耐药性 MTLE 模型鼠
苯妥英钠血药浓度：筛选期第 2、8、15 天，耐药性及不耐药性模型大鼠两组之间苯妥英钠血药浓度均无统计学差异（P>0.05）。两组苯妥英钠血药浓度于第 2、8、15 天之间也均无统计学差异（P>0.05）。
苯妥英钠疗效筛选分组：16 只具有发作的模型鼠中筛选出耐药性模型鼠 6 只，另 10 只为不耐药性模型鼠。苯妥英钠筛选期时，10 只不耐药性模型鼠中有 2 只模型鼠完全无发作，8 只发作频次相较于基线期降低>50%。6 只耐药性模型鼠发作频次不但没有降低，反而比基线期发作频次增高；在不耐药性模型鼠中，苯妥英钠筛选期较基线期及苯妥英钠洗脱期癫痫发作频次有明显降低（P<0.05）；在耐药性模型鼠中，苯妥英钠筛选期较基线期及苯妥英钠洗脱期癫痫发作频次无降低，反而稍有增高，差异无统计学意义（P>0.05），见表 1。
表1
耐药性及不耐药性颞叶内侧癫痫模型大鼠不同时期的癫痫发作频次比较（
）
Table1.
Comparison of seizures frequency of drug-resistant and drug-responsive MTLE rat model during different periods (
)
2.3 耐药性及不耐药性 MTLE 模型大鼠脑中药物浓度
脑微透析液药物浓度：不耐药性模型大鼠与耐药模型大鼠予一次性给药苯妥英钠后 30、60、120、180、240 及 300 min，脑中药物浓度均有统计学差异，耐药模性型鼠低于不耐药性模型鼠（P<0.05），图 2。
图2
耐药性及不耐药性颞叶内侧癫痫模型大鼠脑中苯妥英钠浓度比较
Figure2.
Comparison of phenytoin level in brain of drug-resistant and drug-responsive MTLE rat model
血浆药物浓度：不耐药性模型鼠与耐药性模型大鼠于一次性给药 PHT 后 30、60、120、180、240 及 300 min，外周血中药物浓度均无统计学差异（P>0.05），图 3。
图3
耐药性及不耐药性颞叶内侧癫痫模型大鼠血中苯妥英钠浓度比较
Figure3.
Comparison of phenytoin level in plasma of drug-resistant and drug-responsive MTLE rat model
脑/血浆的时间药物浓度曲线的曲线下面积比值：不耐药性与耐药性模型大鼠的脑/血浆的时间药物浓度曲线的曲线下面积比值之间有统计学差异，耐药性模型鼠明显低于不耐药性模型鼠（0.15±0.03 vs. 0.28±0.05，P<0.05），图 4。
图4
耐药性及不耐药性颞叶内侧癫痫模型大鼠脑中苯妥英钠分布比较
Figure4.
Comparison of phenytoin distribution in brain of drug-resistant and drug-responsive MTLE rat model
2.4 耐药性及不耐药性 MTLE 模型大鼠脑中 P 糖蛋白表达
相较于正常对照大鼠，MTLE 模型鼠海马各区的 P 糖蛋白的表达均明显增高；相较于不耐药模型鼠，耐药性模型鼠海马各区的 P 糖蛋白表达均显著增高（P<0.05）。
3 讨论
建立慢性癫痫动物模型的主要目的是利用模型来探索人类癫痫发作，尤其是耐药性癫痫发作的成因及演变规律。而理想的耐药性癫痫动物模型除应具备慢性、自发性、复发性这 3 个共同特征外，还应具备以下特征：模型的痫性发作应与人类癫痫的临床表现相似；模型的痫性发作应与 EEG 的改变相对应，以便从行为和 EEG 改变两个方面评估 AEDs 的作用效果；标准的 AEDs 不能或只能微弱的控制慢性自主发作；模型应满足进行长期 AEDs 的药效研究，即动物可伴随癫痫发作长期存活，且治疗过程中能保持有效的药物浓度[13]。
目前癫痫动物模型主要有遗传模型和点燃模型，而遗传模型因制作复杂和费用昂贵，且特异性太强，不适合广泛应用，因此目前应用最多的是点燃模型，即化学点燃模型和电点燃模型。电点燃模型由于构建相对快捷，但是其自然发生发展进程与人类 MTLE 病程相悖，并不是适合的模型。我们的研究采用锂-匹罗卡品化学诱导模型早期出现惊厥样发作，经一段潜伏期后慢性期出现自发性反复发作，慢性期的发作在行为学上类似于人类 MTLE 复杂部分性癫痫发作和/或伴继发性全身强直阵挛发作，其同步 EEG 也类似于人类。发生发展进程与人类 MTLE 病程相似[14]。另外，由于锂-匹罗卡品联合使用而毒性作用小，慢性自主发作期持续时间较长，大鼠可长期存活。本课题组前期研究发现锂-匹罗卡品注射致惊厥持续状态后 60 天海马 CA1、CA3 及 DG 区锥体细胞层见部分细胞肿胀、破裂，细胞轮廓模糊、界限不清，呈空泡样变性，胞浆尼氏小体减少，出现神经元的缺失，再次证实了该模型的病理学特点，与人类 MTLE 病理改变一致[15]。因此，该模型无论临床特征还是病理改变均很好的模拟了人类 MTLE。
在此基础上，我们进一步对该模型进行了耐药性的筛查和机制验证。鉴于模型大鼠慢性期自发性反复发作具有波动性和呈簇性出现。因此，非给药期及给药期的持续 VEEG 监测对于完整的准确的评估是必不可少的。另外，我们在设置了基线期和筛选期的基础上还增加了苯妥英钠洗脱期，形成自身对照，以证实模型大鼠发作频次变化与苯妥英钠治疗具有明显的相关性。
该研究中，30 只大鼠中 16 只在癫痫持续状态后慢性期出现自发性反复发作，造模成功率为 53.3%（16/30），其中有 6 只对最大耐受剂量的苯妥英钠给药无效，这一比例与既往报道的研究所筛选的结果是一致的；另 10 只发作频次降低至少有 50%，达到临床上判断药物治疗有效的标准。10 只不耐药性模型鼠中有 2 只在筛选期出现完全无发作。在此期间，不耐药与耐药组之间癫痫发作频次有明显差别，而基线期并无统计学差异。因此我们认为，利用苯妥英钠筛选锂-匹罗卡品诱导持续状态后慢性期具有自发性反复发作的 MTLE 模型大鼠中的不耐药性与耐药性模型的方式是可行的。
综上，以锂-匹罗卡品诱导的 MTLE 大鼠模型为基础，应用苯妥英钠筛选出的耐药性癫痫模型大鼠脑中苯妥英钠药物浓度下降，可作为研究该耐药性机制及药物筛选的理想模型进行后续研究。
