引用本文： 张文娟, 王广文, 杨建仲. 重组人促红细胞生成素对戊四氮致痫大鼠海马蛋白质组学的研究. 癫痫杂志, 2022, 8(6): 529-534. doi: 10.7507/2096-0247.202207006 复制
癫痫是最常见的严重脑部疾病之一，影响全球7 000多万人。其发病率呈双峰分布，婴儿和老年人群的风险最高[1]。癫痫是一种表现为反复痫性发作的慢性脑疾病，神经细胞凋亡是癫痫发作造成神经系统损伤的重要机制。国内有研究发现癫痫发作后1周凋亡的神经细胞达高峰[2]，单次惊厥后亦能引起神经细胞凋亡[3], 并随着惊厥次数的不断增加神经细胞凋亡数目也逐渐增多。近来又有研究发现癫痫发作可使线粒体的结构和功能受损，呼吸链活性氧产生增加、DNA突变、钙超载、脂质过氧化及细胞色素C释放，进而导致神经细胞凋亡[4-5]。而神经细胞的凋亡又增加了癫痫再发的可能性和认知功能的损害[6]。
神经细胞凋亡通路主要包括线粒体通路、死亡受体通路、PARP/AIF通路[7]。神经细胞凋亡是一个可调控的过程，因此通过抑制凋亡的发生，可以减少神经细胞的死亡。随着分子生物学的不断进展，研究发现红细胞生成素（Erythropoietin，EPO）除了其众所周知的促进红细胞生成的作用外，EPO还具有抗凋亡的作用[8-9]。
研究运用蛋白质组学技术，通过分析鉴定重组人促红细胞生成素（Recombinant human erythropoietin，r-HuEPO）对戊四氮（Pentetrazol，PTZ）致痫大鼠海马组织中差异表达的蛋白质，为寻找新的治疗靶点提供有力依据。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 实验动物
所有实验鼠均在标准实验环境（每日光照黑暗12 h交替，室温24±2℃，湿度40%～70%，自由饮食进水）恒温恒湿中饲养。本实验符合山西省人民医院实验动物管理条例的相关规定，实验设计尽可能减少动物使用数量，在实验研究过程中尽量减少大鼠所承受的痛苦。健康6～8周雄性SD大鼠12只，体重230～250 g，由山西省人民医院实验动物中心提供。分为PTZ组6只、PTZ+EPO组6只。该研究获得山西省人民医院医学伦理委员会审核批准。
1.1.2 主要试剂
十二烷基硫酸钠（SDS）、丙酮购自国药公司； Pierce™ Protease Inhibitor Mini Tablets，EDTA-free、PageRuler™ Prestained Protein Ladder，10 to 180 kDa、TMT6plex™ Isobaric Label Reagent Set、Pierce™ Quantitative Colorimetric Peptide Assay购自Thermo Fisher公司；尿素Urea、Ammonium bicarbonate 、PVPP聚乙烯吡咯烷酮、硼砂（四硼酸钠 十水合物 ）、TritonX-100、Bond-Breaker™ TCEP Solution（TCEP）、二硫苏糖醇（DTT）、Trifluoroacetic acid（TFA）购自SIGMA公司；Trypsin酶、TMT10plexTM IsobaricLabel Reagent Set购自Promega公司。
1.1.3 仪器
掌式离心机购自IKA公司，分析天平购自Sartorius公司，酶标仪购自Bio Tek公司，电泳仪购自Bio-Rad，垂直电泳槽、UltiMate3000、台式快速离心浓缩干燥器购自Thermofisher，手动单道移液器、恒温混匀仪购自Eppendorf公司。
1.2 方法
1.2.1 致痫模型制备方法
① 给药：参照文献方法建立动物模型[10]：SE模型制备采用首剂1%PTZ（40 mg/kg）腹腔注射，注射后观察大鼠行为学变化，若10 min后无SE典型表现，以原始剂量的半量（20 mg/kg）注射，评估注射后观察大鼠行为学变化，之后每隔10 min补加小剂量PTZ（10 mg/kg），直至诱导SE模型成功即停止给药。根据 Racine 癫痫发作标准做行为学评估，模型成功标志为在30 min内≥３次Ⅳ～Ⅴ级发作。大鼠惊厥的行为表现采用Racine六级评价标准：0级：无任何反应；Ⅰ级：面肌抽动，节律性咀嚼动作；Ⅱ级：节律性点头或湿狗样抖动(Wet dog shakes，WDS)；Ⅲ级：一侧前肢阵挛；Ⅳ级：双侧前肢阵挛伴站立；Ⅴ级：跌倒、全身强直阵挛性发作。Ⅳ、Ⅴ级发作即为全身性惊厥大发作。制模过程中因长时间持续的强直阵挛发作而死亡或不符合模型要求的大鼠，不予纳入并随机补充。
② 动物分组及给药：将12只体重为230～250 g的6～8周龄SD大鼠随机分为PTZ组、PTZ+ EPO组两组，每组6只。PTZ组：腹腔注射PTZ点燃SE发作后5 min腹腔注射生理盐水[8-9]；PTZ+EPO组：将 r-HuEPO溶于无菌生理盐水中，采用5000 U/kg体重的剂量，在PTZ致痫大鼠建模成功后5 min腹腔注射于大鼠体内。
1.2.2 取海马组织
于24 h后将两组大鼠处死,断头取脑,分离海马组织。在正中线处用剪刀将大鼠头皮剪开，露出颅骨；用大尖镊子夹住两侧眼眶，用眼科剪稍剪除颅骨中线；再用眼科镊夹住颅骨从内向外夹，从下向上逐步去除颅骨；当全脑露岀时，再用眼科镊从嗅球处向下迅速取出大鼠全脑组织（取脑组织时尽量动作迅速，防止蛋白质降解），立即在 4℃或冰上等低温条件下进行分离，分离好的海马组织快速用 PBS清洗组织表面，去除血渍，立即置于高压消毒过的并已经标记好的冻存管中，将螺口盖子旋紧，立即入液氮速冻5 min以上，之后可转移至−80℃冰箱冻存直至蛋白组学实验，避免反复冻融。以上操作均在冰块上执行。
1.2.3 蛋白组学
① 海马蛋白提取：取出样本，按一定比例加入裂解液（8M尿素+1%SDS）和蛋白酶抑制剂；用vortex涡旋振荡混匀；高通量组织研磨仪震荡研磨三次；冰上裂解30 min，期间每10 min震荡混匀一次；4℃，12 000 g离心20 min，收集上清；测定蛋白浓度。
② 于待裂解样品中加入裂解液［1% SDS，8 M urea，1x Protease Inhibitor Cocktail（Roche Ltd. Basel，Switzerland）］，震荡研磨3×400 s，冰上裂解30 min。高速离心15 min（15000 rpm，4℃）后取上清。
③ 蛋白酶解：使用BCA蛋白试剂盒测定上清中的蛋白浓度。随后从各个样本中分别取100 μg蛋白转移至新的EP管中，用8 M urea调至100 μL定容。加入2 μL 0.5 M TCEP于37℃下反应1 h，随后加入4 μL 1 M碘乙酰胺，室温下避光反应40 min。然后，按样品：丙酮（体积比）为1∶5加入−20℃预冷丙酮，并于−20℃下过夜沉淀。随后高速离心（12000 g，20 min，4℃）弃去上清。加入1 mL −20℃预冷的90%丙酮溶液，涡旋混匀清洗样品后，再次高速离心（12 000 g，20 min，4℃）弃上清。清洗步骤重复两次。室温干燥至沉淀表面的丙酮完全挥干后，将其重溶于100 μL 100 mM TEAB，按酶：蛋白（质量比）为1∶50加入trypsin（Promega，Madison，WI），37℃过夜酶解。采用C18除盐柱除盐后，使用肽段定量试剂盒（Pierce™ 23275）测定肽段最终浓度并冻干。
④ TMT标记：肽段混合物采用TMT-6Plex（Thermo Fisher Scientific，MA，USA）标记定量试剂盒，遵照说明书进行标记。标记肽段样品混合后冻干。
⑤ 高pH反相分离：肽段混合物重溶于buffer A（buffer A: 20 mM甲酸铵水溶液, 氨水调节至pH 10.0）后用Ultimate 3000系统（Thermo Fisher scientific，MA，USA）连接反向柱（XBridge C18 column，4.6 mm×250 mm，5 μm，（Waters Corporation，MA，USA））进行高pH分离，分离使用线性梯度，40 min 内5% B 至45% B（B: 80% ACN 中加入20 mM 甲酸铵, 氨水调节至pH 10.0）。柱子在初始条件下平衡15 min，柱流速维持在1 mL/min，柱温维持在30℃。收集到10个馏分。各个馏分在真空浓缩仪中干燥待用。
⑥ nano-HPLC-MS/MS分析：将除盐冻干后的肽段重溶于solvent A（A：0.1% 甲酸水溶液）后经由配备在线纳喷离子源的LC-MS/MS分析。整套系统为串联EASY-nanoLC 1200的 Q Exactive™ HF质谱仪（Thermo Fisher Scientific，MA，USA）。共上样1 μL样品（分析柱：Acclaim PepMap C18，75 μm×25 cm），以60 min的梯度分离样品，柱流量控制在300 nL/min，柱温为40°C，电喷雾电压2 kV，色谱梯度如表1（流动相A相：0.1% 甲酸水溶液；B相：含0.1% 甲酸的ACN溶液）。
表1
色谱梯度
Table1.
Chromatographic gradient
⑦ 数据分析：串联质谱图经过PEAKS Studio version X+（Bioinformatics Solutions Inc.，Waterloo，Canada）分析。PEAKS DB对swissprot_mus_musculus蛋白质数据库（ver 201907，22497 entries）进行搜索，设置trypsin酶解。搜库参数碎片离子质量容许误差：0.02 Da，母离子质量容许误差：7 ppm，最大漏切数：2，固定修饰：Carbamidomethylation 57.02，TMT 6plex（K, N-term）229.16，可变修饰：Acetylation（Protein N-term）42.01，Oxidation（M）15.99。肽段经过1% FDR 和 1 unique peptide质控过滤。筛选差异倍数1倍以上，含有至少条1unique肽段，根据ANOVA算法取P值<0.05的蛋白作为差异蛋白。
2 结 果
经比较分析发现海马组织中139个差异蛋白质点均出现>1.0 倍的表达差异，上调蛋白55，下调蛋白84，合计139（图1）。取P<0.05，Unique Peptides≥1，差异倍数为1以上的差异蛋白数量统计。见图1、2、3、4。经 PEAKS质谱分析鉴定出这 139种蛋白质，取部分蛋白列入表中，详见表2。
图1
火山图 癫痫组和 EPO+PTZ组的图谱
EPO：EPO+PTZ组；CON：PTZ组；红点为上调、蓝点为下调、灰点为没有变化
Figure1. Volcano FigureEPO：EPO+PTZ group; CON: PTZ group; In PTZ group, the red dots were up-regulated, the blue dots were down-regulated, and the gray dots were unchanged
图2
HCA 图 癫痫组和 EPO+PTZ组的图谱
EPO：EPO+PTZ组（红色）；CON：PTZ组（蓝色）
Figure2. HCA figureEPO: EPO+PTZ group (red); CON: PTZ group (blue)
表2
重组人促红细胞生成素对戊四氮致痫大鼠海马组织差异蛋白质谱结果
Table2.
Effect of recombinant human erythropoietin on differential protein profile in hippocampus of pentatetrazol induced eclampsia rats
图3
GO 功能分析图
GO level distribution of the top 20 items with minimum
3 讨 论
众所周知，癫痫发作时，大脑消耗大量的氧气，容易产生氧化应激。高耗氧量导致活性氧的过度产生，会更加促进神经元的坏死和凋亡[11]。从本研究KEGG通路分析（图4）中可以看出癫痫发作后早期代谢通路变化最为显著。
图4
KEGG 通路分析图
横坐标表示该通路中的蛋白占总差异蛋白数量的百分比， 圆圈越大表示该通路上差异蛋白数目越多
Figure4. K EGG Pathway analysis diagramThe horizontal axis represents the percentage of proteins in this pathway to the total number of differential proteins, and the larger the circle is, the more differential proteins in this pathway.
线粒体是细胞进行有氧呼吸的主要场所，线粒体负责的最终氧化的共同途径是三羧酸循环与氧化磷酸化。还原型辅酶Ⅱ（Reduced nicotinamide purine dinucleotide phosphate，NADPH）和还原型黄素二核苷酸（Flavine adenine dinucleotide-reduced，FADH2）参与三羧酸循环 [12-14]。
NADP广泛存在于真核生物各个细胞器中，催化异柠檬酸氧化脱羧成α-酮戊二酸并生成NADH，参与细胞有氧代谢过程中的三羧酸循环 [15]。NADH是线粒体中能量产生链中的控制标志物，NADH是细胞线粒体膜呼吸链的组成部分。
已有研究报道，癫痫组NADH泛醌氧化还原酶（NADH还原酶）下调，提示癫痫发作时神经元确实存在严重的能量代谢紊乱和氧化应激损伤[12-13]。而在本研究EPO+癫痫组的海马组织中NADP表达上调，NADPH表达上调。推测r-HuEPO在癫痫发作过后通过三羧酸循环和磷酸戊糖途径可以使NADP、NADPH表达增高，继之NADH可能也会随之升高，从而维持神经细胞能量代谢，促进神经元有氧功能恢复，阻止神经元凋亡。
硫氧还蛋白系统（Thioredoxin，Trx）由NADPH、硫氧还蛋白还原酶（Thioredoxin reductase，TrxR）和硫氧还蛋白（Thioredoxin，Trx）组成，通过其二硫还原酶活性调节蛋白质二硫醇/二硫平衡，在维持细胞内氧化还原状态方面起着至关重要的作用，这对每个细胞的正常功能至关重要，是防御氧化应激的关键抗氧化系统[16-17]。
Trx系统为依赖硫醇的过氧化物酶提供电子，以快速的反应速率去除活性氧和活性氮。此外，通过与硫氧还蛋白相互作用，Trx系统形成氧化还原依赖的信号通路，对基本的细胞过程，包括代谢、增殖、分化、迁移和凋亡至关重要[18]。
硫氧还蛋白系统与许多不同的蛋白质和不同的代谢和信号通路的相互作用，以及显著的物种差异，使其成为许多医学领域有吸引力的治疗干预靶点，在生物体内发挥着广泛的重要的生理功能[19]。如缺血再灌注损伤，Trx的这种延长寿命的特性（相对于细胞而言）可能保护细胞免受损伤[20]。
研究发现在癫痫发作中存在着细胞氧化还原水平的紊乱，产生的氧自由基加速神经元的凋亡，癫痫发作后TrxR活动增强，提示TrxR参与了抑制神经元凋亡的过程[21]。而本研究显示EPO+PTZ组海马组织中的TrxR表达上调，推测r-HuEPO在癫痫发作后亦可能通过TrxR/Trx途径抑制神经元凋亡。
综上，r-HuEPO在癫痫发作后的早期能通过上调NADP、NADPH，推测r-HuEPO在疾病早期可能通过神经元呼吸链减缓神经元凋亡；r-HuEPO在癫痫发作后的早期能上调TrxR，推测重组红细胞生成素在癫痫发作后可通过某种途径激活TrxR/Trx系统抑制神经元凋亡，其更深层次机制有待于进一步研究。
利益冲突声明 所有作者无利益冲突。
癫痫是最常见的严重脑部疾病之一，影响全球7 000多万人。其发病率呈双峰分布，婴儿和老年人群的风险最高[1]。癫痫是一种表现为反复痫性发作的慢性脑疾病，神经细胞凋亡是癫痫发作造成神经系统损伤的重要机制。国内有研究发现癫痫发作后1周凋亡的神经细胞达高峰[2]，单次惊厥后亦能引起神经细胞凋亡[3], 并随着惊厥次数的不断增加神经细胞凋亡数目也逐渐增多。近来又有研究发现癫痫发作可使线粒体的结构和功能受损，呼吸链活性氧产生增加、DNA突变、钙超载、脂质过氧化及细胞色素C释放，进而导致神经细胞凋亡[4-5]。而神经细胞的凋亡又增加了癫痫再发的可能性和认知功能的损害[6]。
神经细胞凋亡通路主要包括线粒体通路、死亡受体通路、PARP/AIF通路[7]。神经细胞凋亡是一个可调控的过程，因此通过抑制凋亡的发生，可以减少神经细胞的死亡。随着分子生物学的不断进展，研究发现红细胞生成素（Erythropoietin，EPO）除了其众所周知的促进红细胞生成的作用外，EPO还具有抗凋亡的作用[8-9]。
研究运用蛋白质组学技术，通过分析鉴定重组人促红细胞生成素（Recombinant human erythropoietin，r-HuEPO）对戊四氮（Pentetrazol，PTZ）致痫大鼠海马组织中差异表达的蛋白质，为寻找新的治疗靶点提供有力依据。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 实验动物
所有实验鼠均在标准实验环境（每日光照黑暗12 h交替，室温24±2℃，湿度40%～70%，自由饮食进水）恒温恒湿中饲养。本实验符合山西省人民医院实验动物管理条例的相关规定，实验设计尽可能减少动物使用数量，在实验研究过程中尽量减少大鼠所承受的痛苦。健康6～8周雄性SD大鼠12只，体重230～250 g，由山西省人民医院实验动物中心提供。分为PTZ组6只、PTZ+EPO组6只。该研究获得山西省人民医院医学伦理委员会审核批准。
1.1.2 主要试剂
十二烷基硫酸钠（SDS）、丙酮购自国药公司； Pierce™ Protease Inhibitor Mini Tablets，EDTA-free、PageRuler™ Prestained Protein Ladder，10 to 180 kDa、TMT6plex™ Isobaric Label Reagent Set、Pierce™ Quantitative Colorimetric Peptide Assay购自Thermo Fisher公司；尿素Urea、Ammonium bicarbonate 、PVPP聚乙烯吡咯烷酮、硼砂（四硼酸钠 十水合物 ）、TritonX-100、Bond-Breaker™ TCEP Solution（TCEP）、二硫苏糖醇（DTT）、Trifluoroacetic acid（TFA）购自SIGMA公司；Trypsin酶、TMT10plexTM IsobaricLabel Reagent Set购自Promega公司。
1.1.3 仪器
掌式离心机购自IKA公司，分析天平购自Sartorius公司，酶标仪购自Bio Tek公司，电泳仪购自Bio-Rad，垂直电泳槽、UltiMate3000、台式快速离心浓缩干燥器购自Thermofisher，手动单道移液器、恒温混匀仪购自Eppendorf公司。
1.2 方法
1.2.1 致痫模型制备方法
① 给药：参照文献方法建立动物模型[10]：SE模型制备采用首剂1%PTZ（40 mg/kg）腹腔注射，注射后观察大鼠行为学变化，若10 min后无SE典型表现，以原始剂量的半量（20 mg/kg）注射，评估注射后观察大鼠行为学变化，之后每隔10 min补加小剂量PTZ（10 mg/kg），直至诱导SE模型成功即停止给药。根据 Racine 癫痫发作标准做行为学评估，模型成功标志为在30 min内≥３次Ⅳ～Ⅴ级发作。大鼠惊厥的行为表现采用Racine六级评价标准：0级：无任何反应；Ⅰ级：面肌抽动，节律性咀嚼动作；Ⅱ级：节律性点头或湿狗样抖动(Wet dog shakes，WDS)；Ⅲ级：一侧前肢阵挛；Ⅳ级：双侧前肢阵挛伴站立；Ⅴ级：跌倒、全身强直阵挛性发作。Ⅳ、Ⅴ级发作即为全身性惊厥大发作。制模过程中因长时间持续的强直阵挛发作而死亡或不符合模型要求的大鼠，不予纳入并随机补充。
② 动物分组及给药：将12只体重为230～250 g的6～8周龄SD大鼠随机分为PTZ组、PTZ+ EPO组两组，每组6只。PTZ组：腹腔注射PTZ点燃SE发作后5 min腹腔注射生理盐水[8-9]；PTZ+EPO组：将 r-HuEPO溶于无菌生理盐水中，采用5000 U/kg体重的剂量，在PTZ致痫大鼠建模成功后5 min腹腔注射于大鼠体内。
1.2.2 取海马组织
于24 h后将两组大鼠处死,断头取脑,分离海马组织。在正中线处用剪刀将大鼠头皮剪开，露出颅骨；用大尖镊子夹住两侧眼眶，用眼科剪稍剪除颅骨中线；再用眼科镊夹住颅骨从内向外夹，从下向上逐步去除颅骨；当全脑露岀时，再用眼科镊从嗅球处向下迅速取出大鼠全脑组织（取脑组织时尽量动作迅速，防止蛋白质降解），立即在 4℃或冰上等低温条件下进行分离，分离好的海马组织快速用 PBS清洗组织表面，去除血渍，立即置于高压消毒过的并已经标记好的冻存管中，将螺口盖子旋紧，立即入液氮速冻5 min以上，之后可转移至−80℃冰箱冻存直至蛋白组学实验，避免反复冻融。以上操作均在冰块上执行。
1.2.3 蛋白组学
① 海马蛋白提取：取出样本，按一定比例加入裂解液（8M尿素+1%SDS）和蛋白酶抑制剂；用vortex涡旋振荡混匀；高通量组织研磨仪震荡研磨三次；冰上裂解30 min，期间每10 min震荡混匀一次；4℃，12 000 g离心20 min，收集上清；测定蛋白浓度。
② 于待裂解样品中加入裂解液［1% SDS，8 M urea，1x Protease Inhibitor Cocktail（Roche Ltd. Basel，Switzerland）］，震荡研磨3×400 s，冰上裂解30 min。高速离心15 min（15000 rpm，4℃）后取上清。
③ 蛋白酶解：使用BCA蛋白试剂盒测定上清中的蛋白浓度。随后从各个样本中分别取100 μg蛋白转移至新的EP管中，用8 M urea调至100 μL定容。加入2 μL 0.5 M TCEP于37℃下反应1 h，随后加入4 μL 1 M碘乙酰胺，室温下避光反应40 min。然后，按样品：丙酮（体积比）为1∶5加入−20℃预冷丙酮，并于−20℃下过夜沉淀。随后高速离心（12000 g，20 min，4℃）弃去上清。加入1 mL −20℃预冷的90%丙酮溶液，涡旋混匀清洗样品后，再次高速离心（12 000 g，20 min，4℃）弃上清。清洗步骤重复两次。室温干燥至沉淀表面的丙酮完全挥干后，将其重溶于100 μL 100 mM TEAB，按酶：蛋白（质量比）为1∶50加入trypsin（Promega，Madison，WI），37℃过夜酶解。采用C18除盐柱除盐后，使用肽段定量试剂盒（Pierce™ 23275）测定肽段最终浓度并冻干。
④ TMT标记：肽段混合物采用TMT-6Plex（Thermo Fisher Scientific，MA，USA）标记定量试剂盒，遵照说明书进行标记。标记肽段样品混合后冻干。
⑤ 高pH反相分离：肽段混合物重溶于buffer A（buffer A: 20 mM甲酸铵水溶液, 氨水调节至pH 10.0）后用Ultimate 3000系统（Thermo Fisher scientific，MA，USA）连接反向柱（XBridge C18 column，4.6 mm×250 mm，5 μm，（Waters Corporation，MA，USA））进行高pH分离，分离使用线性梯度，40 min 内5% B 至45% B（B: 80% ACN 中加入20 mM 甲酸铵, 氨水调节至pH 10.0）。柱子在初始条件下平衡15 min，柱流速维持在1 mL/min，柱温维持在30℃。收集到10个馏分。各个馏分在真空浓缩仪中干燥待用。
⑥ nano-HPLC-MS/MS分析：将除盐冻干后的肽段重溶于solvent A（A：0.1% 甲酸水溶液）后经由配备在线纳喷离子源的LC-MS/MS分析。整套系统为串联EASY-nanoLC 1200的 Q Exactive™ HF质谱仪（Thermo Fisher Scientific，MA，USA）。共上样1 μL样品（分析柱：Acclaim PepMap C18，75 μm×25 cm），以60 min的梯度分离样品，柱流量控制在300 nL/min，柱温为40°C，电喷雾电压2 kV，色谱梯度如表1（流动相A相：0.1% 甲酸水溶液；B相：含0.1% 甲酸的ACN溶液）。
表1
色谱梯度
Table1.
Chromatographic gradient
⑦ 数据分析：串联质谱图经过PEAKS Studio version X+（Bioinformatics Solutions Inc.，Waterloo，Canada）分析。PEAKS DB对swissprot_mus_musculus蛋白质数据库（ver 201907，22497 entries）进行搜索，设置trypsin酶解。搜库参数碎片离子质量容许误差：0.02 Da，母离子质量容许误差：7 ppm，最大漏切数：2，固定修饰：Carbamidomethylation 57.02，TMT 6plex（K, N-term）229.16，可变修饰：Acetylation（Protein N-term）42.01，Oxidation（M）15.99。肽段经过1% FDR 和 1 unique peptide质控过滤。筛选差异倍数1倍以上，含有至少条1unique肽段，根据ANOVA算法取P值<0.05的蛋白作为差异蛋白。
2 结 果
经比较分析发现海马组织中139个差异蛋白质点均出现>1.0 倍的表达差异，上调蛋白55，下调蛋白84，合计139（图1）。取P<0.05，Unique Peptides≥1，差异倍数为1以上的差异蛋白数量统计。见图1、2、3、4。经 PEAKS质谱分析鉴定出这 139种蛋白质，取部分蛋白列入表中，详见表2。
图1
火山图 癫痫组和 EPO+PTZ组的图谱
EPO：EPO+PTZ组；CON：PTZ组；红点为上调、蓝点为下调、灰点为没有变化
Figure1. Volcano FigureEPO：EPO+PTZ group; CON: PTZ group; In PTZ group, the red dots were up-regulated, the blue dots were down-regulated, and the gray dots were unchanged
图2
HCA 图 癫痫组和 EPO+PTZ组的图谱
EPO：EPO+PTZ组（红色）；CON：PTZ组（蓝色）
Figure2. HCA figureEPO: EPO+PTZ group (red); CON: PTZ group (blue)
表2
重组人促红细胞生成素对戊四氮致痫大鼠海马组织差异蛋白质谱结果
Table2.
Effect of recombinant human erythropoietin on differential protein profile in hippocampus of pentatetrazol induced eclampsia rats
图3
GO 功能分析图
GO level distribution of the top 20 items with minimum
3 讨 论
众所周知，癫痫发作时，大脑消耗大量的氧气，容易产生氧化应激。高耗氧量导致活性氧的过度产生，会更加促进神经元的坏死和凋亡[11]。从本研究KEGG通路分析（图4）中可以看出癫痫发作后早期代谢通路变化最为显著。
图4
KEGG 通路分析图
横坐标表示该通路中的蛋白占总差异蛋白数量的百分比， 圆圈越大表示该通路上差异蛋白数目越多
Figure4. K EGG Pathway analysis diagramThe horizontal axis represents the percentage of proteins in this pathway to the total number of differential proteins, and the larger the circle is, the more differential proteins in this pathway.
线粒体是细胞进行有氧呼吸的主要场所，线粒体负责的最终氧化的共同途径是三羧酸循环与氧化磷酸化。还原型辅酶Ⅱ（Reduced nicotinamide purine dinucleotide phosphate，NADPH）和还原型黄素二核苷酸（Flavine adenine dinucleotide-reduced，FADH2）参与三羧酸循环 [12-14]。
NADP广泛存在于真核生物各个细胞器中，催化异柠檬酸氧化脱羧成α-酮戊二酸并生成NADH，参与细胞有氧代谢过程中的三羧酸循环 [15]。NADH是线粒体中能量产生链中的控制标志物，NADH是细胞线粒体膜呼吸链的组成部分。
已有研究报道，癫痫组NADH泛醌氧化还原酶（NADH还原酶）下调，提示癫痫发作时神经元确实存在严重的能量代谢紊乱和氧化应激损伤[12-13]。而在本研究EPO+癫痫组的海马组织中NADP表达上调，NADPH表达上调。推测r-HuEPO在癫痫发作过后通过三羧酸循环和磷酸戊糖途径可以使NADP、NADPH表达增高，继之NADH可能也会随之升高，从而维持神经细胞能量代谢，促进神经元有氧功能恢复，阻止神经元凋亡。
硫氧还蛋白系统（Thioredoxin，Trx）由NADPH、硫氧还蛋白还原酶（Thioredoxin reductase，TrxR）和硫氧还蛋白（Thioredoxin，Trx）组成，通过其二硫还原酶活性调节蛋白质二硫醇/二硫平衡，在维持细胞内氧化还原状态方面起着至关重要的作用，这对每个细胞的正常功能至关重要，是防御氧化应激的关键抗氧化系统[16-17]。
Trx系统为依赖硫醇的过氧化物酶提供电子，以快速的反应速率去除活性氧和活性氮。此外，通过与硫氧还蛋白相互作用，Trx系统形成氧化还原依赖的信号通路，对基本的细胞过程，包括代谢、增殖、分化、迁移和凋亡至关重要[18]。
硫氧还蛋白系统与许多不同的蛋白质和不同的代谢和信号通路的相互作用，以及显著的物种差异，使其成为许多医学领域有吸引力的治疗干预靶点，在生物体内发挥着广泛的重要的生理功能[19]。如缺血再灌注损伤，Trx的这种延长寿命的特性（相对于细胞而言）可能保护细胞免受损伤[20]。
研究发现在癫痫发作中存在着细胞氧化还原水平的紊乱，产生的氧自由基加速神经元的凋亡，癫痫发作后TrxR活动增强，提示TrxR参与了抑制神经元凋亡的过程[21]。而本研究显示EPO+PTZ组海马组织中的TrxR表达上调，推测r-HuEPO在癫痫发作后亦可能通过TrxR/Trx途径抑制神经元凋亡。
综上，r-HuEPO在癫痫发作后的早期能通过上调NADP、NADPH，推测r-HuEPO在疾病早期可能通过神经元呼吸链减缓神经元凋亡；r-HuEPO在癫痫发作后的早期能上调TrxR，推测重组红细胞生成素在癫痫发作后可通过某种途径激活TrxR/Trx系统抑制神经元凋亡，其更深层次机制有待于进一步研究。
利益冲突声明 所有作者无利益冲突。
