癫痫是一种常见的神经系统疾病，病因复杂，发作形式多样，不同年龄均可患病。目前虽然有多种抗癫痫发作药物可用，但仍有1/3的患者药物治疗效果差。因此，对癫痫更好的诊断和治疗显得尤为重要。外泌体是直径在30～150 nm的细胞外囊泡，具有强大细胞间信息传递功能，在中枢神经系统中也具有重要的作用。神经细胞释放的外泌体在局部的微环境中能够参与神经的发育和可塑性，调节神经炎症，减少神经元的丢失。而且，研究发现外泌体中的某些蛋白或微小核糖核酸（micro ribonucleic acid，miRNA）与癫痫高度相关，在癫痫的发生发展中出现改变，使其在癫痫的预防和早期诊断中发挥重要的临床意义。此外，外泌体具有更好的生物相容性和更低的免疫原性，其体积小，可以有效地避免单核巨噬细胞的吞噬作用，并且表面携带的蛋白质具有很强的靶向组织或细胞的归巢能力，其还可以穿过血脑屏障到达颅内，因此外泌体具有天然药物输送的优势。本文就外泌体在癫痫领域的应用进行综述，提高科研及临床工作者对外泌体的认识。
引用本文： 卢倩, 张淇, 王秋红, 敦硕, 王嘉, 邹丽萍. 外泌体在癫痫的诊断与治疗中的应用. 癫痫杂志, 2023, 9(4): 306-309. doi: 10.7507/2096-0247.202304010 复制
癫痫是一种常见且严重的神经系统疾病，由于神经元超同步化放电导致的，以反复癫痫发作为特征[1]。全球的癫痫患者超过7 000万人，癫痫发作形式多样，不同年龄均可患病，但多在1岁前起病[1-2]。癫痫病因复杂，主要分为六类，分别为结构性、遗传性、感染性、代谢性、免疫性和病因不明[3]。目前临床上有20多种不同的抗癫痫发作药物，经过适当的治疗，多数患者的癫痫发作可以得到控制，但仍有1/3的患者会发展成为药物难治性癫痫[1]。因此对癫痫的诊断和治疗是研究的热点和难点。
外泌体是具有双层脂质膜，直径为30～150 nm的细胞外囊泡[4]。外泌体在绵羊网织红细胞的体外培养过程中首先发现，最初外泌体被认为是细胞损伤而产生的细胞废物，或者是用于维持细胞稳定的产物，往往被研究者忽视[5]。近年来，由于外泌体强大细胞间信息传递功能而受到越来越多的关注。在中枢神经系统中，神经细胞释放的外泌体在局部微环境中发挥作用，参与神经发育和可塑性，调节神经炎症，减少神经元丢失等[6-7]。外泌体在癫痫的诊断和治疗中发挥重要作用，本文就外泌体在癫痫中的应用进行综述，提高科研及临床工作者的认识。
1 外泌体概述
外泌体是由多泡体分泌。细胞首先内吞形成早期内体，早期内体膜向内以出芽方式形成内囊泡，后多泡体与细胞膜融合，内囊泡被释放到细胞外空间，称为外泌体[8]。外泌体属于细胞外囊泡的一种，不同于微囊泡和凋亡小体。微囊泡是细胞以出芽方式产生，直径为150～1 000 nm；凋亡小体直径1～5 μm，包含多种细胞内片段、细胞器和胞浆内容物等[4]。
外泌体中包含多种成分，如脂质、蛋白质、DNA、mRNA、微小核糖核酸（micro Ribonucleic acid，miRNA）等，可以反映亲代细胞的病理生理特点[9]。外泌体中富含具有各种功能蛋白质，比如参与细胞侵袭、融合的跨膜蛋白（CD9、CD63、CD81和CD82）；参与膜转运相关蛋白Rab蛋白等[4]。外泌体中还含有多种类型RNA，2007年首次报道了来源肥大细胞的外泌体中含有mRNA和miRNA[10]。在人血浆的外泌体RNA种类中miRNAs含量最多。miRNA是一类非编码RNA，长度约为22个核苷酸，通过与靶mRNA的3’-UTR结合，降低其稳定性，下调翻译，参与转录后水平基因表达调控[11]。单独miRNA即可影响数百个靶基因表达[11]。大约70%的miRNAs在中枢神经系统中表达，对中枢神经发育中发挥重要作用[12]。
几乎所有的细胞都可以产生外泌体，外泌体也广泛存在于血液、脑脊液等各种体液中[13]。目前，不同的外泌体分离技术各有其优缺点[14]，其中应用最广泛、最靠谱的方法是差速离心法，经过一系列离心步骤纯化得到外泌体。
外泌体被邻近的靶细胞摄取或通过循环系统运输到其他部位而发挥功能。靶细胞摄取外泌体有三种方式：与质膜融合、受体-配体结合、内吞的方式[12]。神经细胞间的外泌体摄取具有高度特异性。例如来自神经母细胞瘤的外泌体可以与神经元和神经胶质细胞结合，但优先被神经胶质细胞摄取；来自皮层神经元的外泌体则完全被神经元摄取[15]。这种特异性的摄取外泌体的具体机制尚不清楚，可能是外泌体和靶细胞表面分子相互作用的结果[9]。
2 中枢神经系统中不同细胞来源外泌体的研究
不同神经细胞来源的外泌体对中枢神经系统的影响不同。神经元来源的外泌体在神经发育过程中调节轴突、树突的生长而影响神经传递[14，16]。神经元可分泌含有miRNA Let-7c和miRNA-21的外泌体，其与Toll样受体7（Toll-like receptor-7，TLR-7）结合，而TLR-7的激活将抑制树突和轴突的生长，而在TLR-7敲除小鼠中这种抑制作用消失[16]。有研究发现用γ-氨基丁酸（gamma-aminobutyric acid，GABA）受体拮抗剂处理可使皮层神经元的外泌体分泌增加，而使用α-氨基-3-羟基-5-甲基-4-异恶唑丙酸（α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazole-propionicacid，AMPA）受体拮抗剂或N-甲基-D-天冬氨酸（N-methyl-D-aspartic acid， NMDA）受体拮抗剂则外泌体分泌减少，表明外泌体分泌受谷氨酸能突触活性的调节[14]。神经元可以分泌含有脯氨酸的的跨膜蛋白（Proline-rich 7，PRR7）的外泌体，相邻神经元通过摄取含有PRR7的外泌体能减少谷氨酸能突触的数量[14]。
星形胶质细胞来源外泌体包含成纤维细胞生长因子2和血管内皮生长因子，具有神经保护作用[17]。在缺氧和缺少葡萄糖情况下，星形胶质细胞分泌外泌体可以抑制神经元凋亡，增强神经元活力，改善神经元损伤[18]。
小胶质细胞占总胶质细胞的10%，相当于大脑和脊髓的巨噬细胞，具有促炎表型的小胶质细胞分泌的外泌体，利于神经炎症的发展。小胶质细胞暴露于脂多糖中可使包含促炎性细胞因子、miRNA-155、miRNA-357的外泌体分泌增加[14]。少突胶质细胞形成髓鞘，使得动作电位沿轴突快速的传播。少突胶质细胞分泌外泌体具有神经保护功能[19]。
已证明来自神经祖细胞的外泌体可通过miRNA-21a促进神经元分化及神经发生[20]。将啮齿动物外泌体注射到生后4天的小鼠的侧脑室中，发现外泌体使得齿状回颗粒细胞层细胞增殖[21]。将人类诱导多能干细胞分化神经元分泌的外泌体加入到人类原代神经培养物中，结果发现外泌体可以促进细胞增殖和神经元分化、神经发生[21]。
3 外泌体在癫痫诊断中的研究
外泌体是可以用于癫痫诊断和预后的潜在的高敏感生物标志物，在人和动物模型的研究表明外泌体的某些miRNA与癫痫高度相关，为癫痫的早期诊断和预防具有重要的临床意义。在小鼠海人酸癫痫模型中发现小鼠脑内外泌体分泌增加，在癫痫持续状态后2周仍可检测到增多的外泌体[22]。外泌体可以反映亲代细胞的状态，大量数据表明外泌体所含有的蛋白或miRNA在癫痫中发生发展中发生改变，因此外泌体是理想的非侵入性生物标志物。
在癫痫患者和健康对照人群血清外泌体进行蛋白质检测，发现76种蛋白质差异表达，其中6种蛋白质表达增加，通过大量临床样本和慢性癫痫小鼠模型中分析，发现凝血因子IX（coagulation factor IX，F9）和血小板反应蛋白-1（Thrombospondin-1，TSP-1）具有显著差异，可用于癫痫诊断的生物标志物[23]。
在颞叶癫痫大鼠模型中发现包含miRNA-346和miRNA-331-3p的外泌体在前脑部位减少[24]。通过比较颞叶癫痫、海马硬化患者与健康人血浆外泌体RNA含量，发现miRNA-3613-5p、miRNA-4668-5p、miRNA-8071、miRNA-197-5p的表达存在差异[25]。还有研究发现颞叶癫痫患者癫痫发作后血浆中miRNA-328-3p比例增加[26]。在9例局灶性皮层发育不良患者和4名健康对照者的外周血分离血清外泌体，通过测序分析，发现miRNA194-2-5p、miRNA-15a-5p、miRNA-132-3p和miRNA-145-5p在局灶性皮层发育不良患者中均表达上调，其可能是局灶性皮层发育不良和难治性癫痫患者潜在的生物标志物[27]。79例遗传性癫痫患者和67名健康对照者血清miRNA表达情况分析，癫痫患者的miRNA-146a和miRNA-155表达水平明显上调，有可能参与癫痫发生[28]。在一项针对儿童癫痫患者的研究中，选取同性别、同年龄的健康儿童作为健康对照组，两组人群空腹状态下采集血清样本并提取外泌体，结果发现癫痫组儿童血清外泌体miRNA-155表达水平明显更高，并且与癫痫病程、脑电图异常程度呈正相关，即随着癫痫病程的延长，脑电图异常越严重，miRNA-155表达水平逐渐升高[29]。
4 外泌体在癫痫治疗中的研究
外泌体来源于人体，理论上具有更好的生物相容性和更低的免疫原性，其体积小，可有效避免单核巨噬细胞的吞噬作用。外泌体表面携带的蛋白质具有很强的靶向组织或细胞的归巢能力，还可以穿过生物屏障（如血脑屏障），因此具有天然药物输送的优势，是具有前景的靶向药物载体[30]。因此，外泌体应用于多种疾病的治疗中，如心血管疾病、肿瘤疾病、免疫性疾病，神经系统疾病如癫痫等[31-34]，多数仍处于进行中，一些初步的研究结果显示出外泌体治疗的安全性和有效性。
海人酸癫痫模型中，在癫痫持续状态后通过鼻内给药的方式，给予人骨髓间充质干细胞来源的外泌体，结果发现外泌体可以有效的分布到双侧前脑多个区域的神经元和小胶质细胞内，并且脑损伤区域神经元对外泌体摄取更高[35]。从人骨髓间充质干细胞中纯化A1外泌体，其具有强大的抗炎特性。在小鼠匹鲁卡品癫痫模型中，将A1外泌体通过鼻内给药的方式，结果显示谷氨酸能和GABA能神经元损伤减少，并大大减轻了海马的炎症反应，有效预防癫痫持续状态诱导的认知和记忆障碍[36]。间充质干细胞来源外泌体通过Nrf2-NF-κB信号通路参与调节星形胶质细胞活化，在癫痫模型小鼠中可以减弱反应性星形胶质细胞增生和炎症反应[37]，发挥抗癫痫作用。
5 小结与展望
外泌体是纳米医学领域的一种有前途的工具，在癫痫的诊断和治疗方面发挥重要作用。但外泌体的临床应用仍处于起步阶段，在临床充分发挥其潜力之前，外泌体的分离、纯化、生产等仍存在一些困难，当使用外泌体治疗时，必须实现大规模稳定的制备方法。充分了解外泌体生物学的基本方面（外泌体产生、靶细胞等）和下游的信号转导，是外泌体在癫痫的诊断和治疗中应用的关键。如何更好地将外泌体应用于癫痫疾病领域，将来仍然需要进一步全方位、多方面的研究。
利益冲突 所有作者无利益冲突。
癫痫是一种常见且严重的神经系统疾病，由于神经元超同步化放电导致的，以反复癫痫发作为特征[1]。全球的癫痫患者超过7 000万人，癫痫发作形式多样，不同年龄均可患病，但多在1岁前起病[1-2]。癫痫病因复杂，主要分为六类，分别为结构性、遗传性、感染性、代谢性、免疫性和病因不明[3]。目前临床上有20多种不同的抗癫痫发作药物，经过适当的治疗，多数患者的癫痫发作可以得到控制，但仍有1/3的患者会发展成为药物难治性癫痫[1]。因此对癫痫的诊断和治疗是研究的热点和难点。
外泌体是具有双层脂质膜，直径为30～150 nm的细胞外囊泡[4]。外泌体在绵羊网织红细胞的体外培养过程中首先发现，最初外泌体被认为是细胞损伤而产生的细胞废物，或者是用于维持细胞稳定的产物，往往被研究者忽视[5]。近年来，由于外泌体强大细胞间信息传递功能而受到越来越多的关注。在中枢神经系统中，神经细胞释放的外泌体在局部微环境中发挥作用，参与神经发育和可塑性，调节神经炎症，减少神经元丢失等[6-7]。外泌体在癫痫的诊断和治疗中发挥重要作用，本文就外泌体在癫痫中的应用进行综述，提高科研及临床工作者的认识。
1 外泌体概述
外泌体是由多泡体分泌。细胞首先内吞形成早期内体，早期内体膜向内以出芽方式形成内囊泡，后多泡体与细胞膜融合，内囊泡被释放到细胞外空间，称为外泌体[8]。外泌体属于细胞外囊泡的一种，不同于微囊泡和凋亡小体。微囊泡是细胞以出芽方式产生，直径为150～1 000 nm；凋亡小体直径1～5 μm，包含多种细胞内片段、细胞器和胞浆内容物等[4]。
外泌体中包含多种成分，如脂质、蛋白质、DNA、mRNA、微小核糖核酸（micro Ribonucleic acid，miRNA）等，可以反映亲代细胞的病理生理特点[9]。外泌体中富含具有各种功能蛋白质，比如参与细胞侵袭、融合的跨膜蛋白（CD9、CD63、CD81和CD82）；参与膜转运相关蛋白Rab蛋白等[4]。外泌体中还含有多种类型RNA，2007年首次报道了来源肥大细胞的外泌体中含有mRNA和miRNA[10]。在人血浆的外泌体RNA种类中miRNAs含量最多。miRNA是一类非编码RNA，长度约为22个核苷酸，通过与靶mRNA的3’-UTR结合，降低其稳定性，下调翻译，参与转录后水平基因表达调控[11]。单独miRNA即可影响数百个靶基因表达[11]。大约70%的miRNAs在中枢神经系统中表达，对中枢神经发育中发挥重要作用[12]。
几乎所有的细胞都可以产生外泌体，外泌体也广泛存在于血液、脑脊液等各种体液中[13]。目前，不同的外泌体分离技术各有其优缺点[14]，其中应用最广泛、最靠谱的方法是差速离心法，经过一系列离心步骤纯化得到外泌体。
外泌体被邻近的靶细胞摄取或通过循环系统运输到其他部位而发挥功能。靶细胞摄取外泌体有三种方式：与质膜融合、受体-配体结合、内吞的方式[12]。神经细胞间的外泌体摄取具有高度特异性。例如来自神经母细胞瘤的外泌体可以与神经元和神经胶质细胞结合，但优先被神经胶质细胞摄取；来自皮层神经元的外泌体则完全被神经元摄取[15]。这种特异性的摄取外泌体的具体机制尚不清楚，可能是外泌体和靶细胞表面分子相互作用的结果[9]。
2 中枢神经系统中不同细胞来源外泌体的研究
不同神经细胞来源的外泌体对中枢神经系统的影响不同。神经元来源的外泌体在神经发育过程中调节轴突、树突的生长而影响神经传递[14，16]。神经元可分泌含有miRNA Let-7c和miRNA-21的外泌体，其与Toll样受体7（Toll-like receptor-7，TLR-7）结合，而TLR-7的激活将抑制树突和轴突的生长，而在TLR-7敲除小鼠中这种抑制作用消失[16]。有研究发现用γ-氨基丁酸（gamma-aminobutyric acid，GABA）受体拮抗剂处理可使皮层神经元的外泌体分泌增加，而使用α-氨基-3-羟基-5-甲基-4-异恶唑丙酸（α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazole-propionicacid，AMPA）受体拮抗剂或N-甲基-D-天冬氨酸（N-methyl-D-aspartic acid， NMDA）受体拮抗剂则外泌体分泌减少，表明外泌体分泌受谷氨酸能突触活性的调节[14]。神经元可以分泌含有脯氨酸的的跨膜蛋白（Proline-rich 7，PRR7）的外泌体，相邻神经元通过摄取含有PRR7的外泌体能减少谷氨酸能突触的数量[14]。
星形胶质细胞来源外泌体包含成纤维细胞生长因子2和血管内皮生长因子，具有神经保护作用[17]。在缺氧和缺少葡萄糖情况下，星形胶质细胞分泌外泌体可以抑制神经元凋亡，增强神经元活力，改善神经元损伤[18]。
小胶质细胞占总胶质细胞的10%，相当于大脑和脊髓的巨噬细胞，具有促炎表型的小胶质细胞分泌的外泌体，利于神经炎症的发展。小胶质细胞暴露于脂多糖中可使包含促炎性细胞因子、miRNA-155、miRNA-357的外泌体分泌增加[14]。少突胶质细胞形成髓鞘，使得动作电位沿轴突快速的传播。少突胶质细胞分泌外泌体具有神经保护功能[19]。
已证明来自神经祖细胞的外泌体可通过miRNA-21a促进神经元分化及神经发生[20]。将啮齿动物外泌体注射到生后4天的小鼠的侧脑室中，发现外泌体使得齿状回颗粒细胞层细胞增殖[21]。将人类诱导多能干细胞分化神经元分泌的外泌体加入到人类原代神经培养物中，结果发现外泌体可以促进细胞增殖和神经元分化、神经发生[21]。
3 外泌体在癫痫诊断中的研究
外泌体是可以用于癫痫诊断和预后的潜在的高敏感生物标志物，在人和动物模型的研究表明外泌体的某些miRNA与癫痫高度相关，为癫痫的早期诊断和预防具有重要的临床意义。在小鼠海人酸癫痫模型中发现小鼠脑内外泌体分泌增加，在癫痫持续状态后2周仍可检测到增多的外泌体[22]。外泌体可以反映亲代细胞的状态，大量数据表明外泌体所含有的蛋白或miRNA在癫痫中发生发展中发生改变，因此外泌体是理想的非侵入性生物标志物。
在癫痫患者和健康对照人群血清外泌体进行蛋白质检测，发现76种蛋白质差异表达，其中6种蛋白质表达增加，通过大量临床样本和慢性癫痫小鼠模型中分析，发现凝血因子IX（coagulation factor IX，F9）和血小板反应蛋白-1（Thrombospondin-1，TSP-1）具有显著差异，可用于癫痫诊断的生物标志物[23]。
在颞叶癫痫大鼠模型中发现包含miRNA-346和miRNA-331-3p的外泌体在前脑部位减少[24]。通过比较颞叶癫痫、海马硬化患者与健康人血浆外泌体RNA含量，发现miRNA-3613-5p、miRNA-4668-5p、miRNA-8071、miRNA-197-5p的表达存在差异[25]。还有研究发现颞叶癫痫患者癫痫发作后血浆中miRNA-328-3p比例增加[26]。在9例局灶性皮层发育不良患者和4名健康对照者的外周血分离血清外泌体，通过测序分析，发现miRNA194-2-5p、miRNA-15a-5p、miRNA-132-3p和miRNA-145-5p在局灶性皮层发育不良患者中均表达上调，其可能是局灶性皮层发育不良和难治性癫痫患者潜在的生物标志物[27]。79例遗传性癫痫患者和67名健康对照者血清miRNA表达情况分析，癫痫患者的miRNA-146a和miRNA-155表达水平明显上调，有可能参与癫痫发生[28]。在一项针对儿童癫痫患者的研究中，选取同性别、同年龄的健康儿童作为健康对照组，两组人群空腹状态下采集血清样本并提取外泌体，结果发现癫痫组儿童血清外泌体miRNA-155表达水平明显更高，并且与癫痫病程、脑电图异常程度呈正相关，即随着癫痫病程的延长，脑电图异常越严重，miRNA-155表达水平逐渐升高[29]。
4 外泌体在癫痫治疗中的研究
外泌体来源于人体，理论上具有更好的生物相容性和更低的免疫原性，其体积小，可有效避免单核巨噬细胞的吞噬作用。外泌体表面携带的蛋白质具有很强的靶向组织或细胞的归巢能力，还可以穿过生物屏障（如血脑屏障），因此具有天然药物输送的优势，是具有前景的靶向药物载体[30]。因此，外泌体应用于多种疾病的治疗中，如心血管疾病、肿瘤疾病、免疫性疾病，神经系统疾病如癫痫等[31-34]，多数仍处于进行中，一些初步的研究结果显示出外泌体治疗的安全性和有效性。
海人酸癫痫模型中，在癫痫持续状态后通过鼻内给药的方式，给予人骨髓间充质干细胞来源的外泌体，结果发现外泌体可以有效的分布到双侧前脑多个区域的神经元和小胶质细胞内，并且脑损伤区域神经元对外泌体摄取更高[35]。从人骨髓间充质干细胞中纯化A1外泌体，其具有强大的抗炎特性。在小鼠匹鲁卡品癫痫模型中，将A1外泌体通过鼻内给药的方式，结果显示谷氨酸能和GABA能神经元损伤减少，并大大减轻了海马的炎症反应，有效预防癫痫持续状态诱导的认知和记忆障碍[36]。间充质干细胞来源外泌体通过Nrf2-NF-κB信号通路参与调节星形胶质细胞活化，在癫痫模型小鼠中可以减弱反应性星形胶质细胞增生和炎症反应[37]，发挥抗癫痫作用。
5 小结与展望
外泌体是纳米医学领域的一种有前途的工具，在癫痫的诊断和治疗方面发挥重要作用。但外泌体的临床应用仍处于起步阶段，在临床充分发挥其潜力之前，外泌体的分离、纯化、生产等仍存在一些困难，当使用外泌体治疗时，必须实现大规模稳定的制备方法。充分了解外泌体生物学的基本方面（外泌体产生、靶细胞等）和下游的信号转导，是外泌体在癫痫的诊断和治疗中应用的关键。如何更好地将外泌体应用于癫痫疾病领域，将来仍然需要进一步全方位、多方面的研究。
利益冲突 所有作者无利益冲突。