目的 構(gòu)建豬TGF-β1 重組慢病毒表達(dá)載體,并轉(zhuǎn)染BMSCs,為構(gòu)建組織工程骨軟骨提供TGF-β1 修飾的BMSCs,作為持續(xù)、高效的種子細(xì)胞。 方法 將已獲取的目的基因TGF-β1 cDNA 包裝至慢病毒載體中,通過PCR及基因測序?qū)﹃栃钥寺∵M(jìn)行鑒定,并測定病毒滴度。取2 月齡巴馬香豬(體重約15 kg)骨髓制備BMSCs,取第2 ~ 3代用于實(shí)驗(yàn)。用TGF-β1 重組慢病毒載體以感染復(fù)數(shù)(multiplicity of infection, MOI)為10、50、70、100、150 分別轉(zhuǎn)染BMSCs,通過激光共聚焦顯微鏡觀察,并以Western blot 檢測不同MOI 值的轉(zhuǎn)染效果,確定最佳MOI 值。用TGF-β1 重組慢病毒載體以最佳MOI 值感染BMSCs 作為實(shí)驗(yàn)組,以空載體轉(zhuǎn)染的BMSCs(空載體組)及未轉(zhuǎn)染的BMSCs(空白組)作為對照,通過RT-PCR、免疫細(xì)胞化學(xué)染色、ELISA 等方法檢測TGF-β1 基因及蛋白在BMSCs 中的表達(dá)情況,并檢測Ⅱ型膠原表達(dá)情況。 結(jié)果 經(jīng)PCR 及基因測序鑒定TGF-β1 重組慢病毒表達(dá)載體構(gòu)建成功,并成功轉(zhuǎn)染BMSCs,激光共聚焦顯微鏡下可觀察到強(qiáng)綠色熒光;Western blot 示MOI 為70 時轉(zhuǎn)染效果最佳;RT-PCR 示實(shí)驗(yàn)組TGF-β1 基因的表達(dá)量明顯高于空載體組及空白組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P lt; 0.05);免疫細(xì)胞化學(xué)染色示實(shí)驗(yàn)組TGF-β1 蛋白及Ⅱ型膠原呈陽性表達(dá),而空載體組及空白組呈弱陽性或陰性表達(dá);ELISA 示實(shí)驗(yàn)組TGF-β1 蛋白至轉(zhuǎn)染后21 d 仍有較高表達(dá)。 結(jié)論 TGF-β1 重組慢病毒表達(dá)載體可成功轉(zhuǎn)染BMSCs,TGF-β1 蛋白可長期、穩(wěn)定表達(dá),促使BMSCs 向成軟骨細(xì)胞方向分化。
引用本文: 賴建明,林建華,林文平,吳朝陽. 豬TGF-β1 基因重組慢病毒載體的構(gòu)建及其在BMSCs 中的表達(dá). 中國修復(fù)重建外科雜志, 2012, 26(7): 849-844. doi: 復(fù)制
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