目的 神經(jīng)元純化是各種神經(jīng)細(xì)胞實驗研究必不可少的實驗步驟，但目前少見神經(jīng)元純化過程中各種因素對神經(jīng)軸突影響的實驗報道。探討簡便有效的背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元（dorsal root ganglion neurons，DRGn）細(xì)胞純化方法和神經(jīng)元培養(yǎng)體系內(nèi)相關(guān)因素對 β3-tubulin 陽性神經(jīng)軸突生長狀態(tài)的影響。? 方法 取新生 3 d 的 SD 大鼠背根神經(jīng)節(jié)（dorsal root ganglion，DRG）制成細(xì)胞懸液，根據(jù)玻片包被底物不同分為 D- 多聚賴氨酸（poly-D-lysine，PDL）組、PDL/ 層粘連蛋白（Laminin，LN）組和Ⅰ型膠原（collagen Ⅰ，Col Ⅰ）組，分別差速貼壁 10、20、30、40、50、60、70、80、
90、100 min，倒置相差顯微鏡觀察細(xì)胞貼壁情況，并采用免疫熒光染色觀察各時間點 DRGn 細(xì)胞和非 DRGn 細(xì)胞貼壁數(shù)
量。將 DRG 制備組織塊培養(yǎng) 72 h，采用完全隨機(jī)設(shè)計的方法觀察底物（PDL、PDL/LN、Col Ⅰ）、FBS（0、5%、10%）、五氟尿嘧啶（5-fuorouracil， 5-Fu， 0、 20、 40 μmol/L）和阿糖胞苷（cytrarabine， Ara-C， 0、 10、 20 μmol/L）不同水平對 DRG 整節(jié)培養(yǎng)中 β3-tubulin 陽性軸突長度和單位陽性軸突分支末梢數(shù)量的影響。? 結(jié)果 倒置相差顯微鏡和倒置熒光顯微鏡觀察顯示，細(xì)胞接種后即開始貼壁，貼壁 10 min 后移除細(xì)胞懸液仍可見 DRGn 細(xì)胞及非 DRGn 細(xì)胞貼壁生長。PDL 組：貼壁 10、30 min，神經(jīng)元特異性烯醇化酶（neuron-specifc enolase，NSE）陰性（NSE-
）細(xì)胞數(shù)高于 NSE+細(xì)胞數(shù)（P  lt; 0.05）；貼壁 80、 90、 100 min， NSE+細(xì)胞數(shù)大于 NSE-細(xì)胞數(shù)（P  lt; 0.05）。PDL/LN 組：貼壁 10、 20、 30、 40、 50 min， NSE+細(xì)胞數(shù)及 NSE-細(xì)胞數(shù)差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P  gt; 0.05）；貼壁 60、70、80、90、100 min，NSE+細(xì)胞數(shù)大于 NSE-細(xì)胞數(shù)（P  lt; 0.05）。Col Ⅰ組：貼壁 10 ～ 40 min，NSE-細(xì)胞數(shù)大于 NSE+細(xì)胞數(shù)，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P  gt; 0.05）；貼壁 70、80、90、100 min，NSE+細(xì)胞數(shù)大于 NSE-細(xì)胞數(shù)（P  lt; 0.05）。DRG 整節(jié)培養(yǎng) 72 h 后，底物水平為 PDL/LN 時軸突生長分化最好，與 PDL 水平和ColⅠ水平比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P  lt; 0.05）； FBS為5%水平時β3-tubulin單位陽性軸突分支末梢數(shù)最大（P  lt; 0.05），但陽性軸突長度在 0、5% 和 10% 3 個濃度水平比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P  gt; 0.05）； 5-Fu 在 0 濃度水平時 β3-tubulin 單位陽性軸突分支末梢數(shù)及陽性軸突長度均最大，與 20、40 μmol/L 濃度水平比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P  lt; 0.05）； Ara-C 在 0 和
10 μmol/L 濃度水平的陽性軸突分支末梢數(shù)相同，均高于 20 μmol/L 水平（P  lt; 0.05）；而陽性軸突長度在 10 μmol/L 水平時最長，與 0 和 20 μmol/L 濃度比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P lt; 0.05）。? 結(jié)論 將 DRGn 細(xì)胞懸液在 PDL 包被的玻片上差速貼壁 30 min，再將懸液吸出進(jìn)行接種培養(yǎng)，可在一定程度上起到分離純化神經(jīng)元細(xì)胞的作用。行 DRG 整節(jié)培養(yǎng)時，選擇
神經(jīng)元專用培養(yǎng)基聯(lián)合 PDL/LN 細(xì)胞培養(yǎng)底物和 10 μmol/L Ara-C，可獲得最理想的 β3-tubulin 陽性軸突生長分化效果。

引用本文： 李駿,馮大雄,黃貽澤,葉飛. 差速貼壁純化及純化培養(yǎng)對神經(jīng)軸突的影響. 中國修復(fù)重建外科雜志, 2010, 24(2): 172-179. doi: 復(fù)制