目的 構(gòu)建同時表達(dá)綠色熒光蛋白（green fluorescent protein，GFP）報(bào)告基因和人類Nel1 型蛋白[homo sapiens NEL-like 1，NELL1）] 基因的重組腺病毒載體pAdxsi-GFP-NELL1，并轉(zhuǎn)染大鼠BMSCs，觀察其表達(dá)情況，為進(jìn)一步研究NELL1 蛋白的成骨作用提供理論基礎(chǔ)。 方法 設(shè)計(jì)特異性引物從NELL1 質(zhì)粒中擴(kuò)增NELL1，將測序正確的片段用XhoI/BglII 酶切處理，定向插入至pShuttle-GFP-CMV（-）TEMP 重組穿梭載體，然后將驗(yàn)證正確的重組穿梭質(zhì)粒中的插入片段轉(zhuǎn)移至pAdxsi 載體構(gòu)建重組腺病毒載體質(zhì)粒，用PacI 限制性內(nèi)切酶線性化后轉(zhuǎn)染HEK293 細(xì)胞，擴(kuò)增純化重組腺病毒，半數(shù)組織培養(yǎng)感染量法測定重組腺病毒滴度。培養(yǎng)大鼠BMSCs，采用流式細(xì)胞儀鑒定表面標(biāo)志物，并行成骨、成脂誘導(dǎo)鑒定。用構(gòu)建的pAdxsi-GFP-NELL1 及空病毒pAdxsi-GFP（作為對照）轉(zhuǎn)染鑒定正確的BMSCs，RT-PCR 檢測NELL1 的表達(dá)，免疫熒光檢測GFP 基因及NELL1 的表達(dá)情況，細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒（cell counting kit-8，CCK-8）法檢測對細(xì)胞增殖的影響。 結(jié)果 成功構(gòu)建同時表達(dá)NELL1 和GFP 基因的重組腺病毒載體（pAdxsi-GFP-NELL1），純化后獲得滴度達(dá)1 × 1011 pfu/mL 的重組腺病毒。成功分離獲得大鼠BMSCs 并傳代、純化，經(jīng)流式細(xì)胞儀鑒定表面標(biāo)志物及成骨、成脂誘導(dǎo)鑒定為BMSCs。pAdxsi-GFP-NELL1 轉(zhuǎn)染BMSCs 后，RT-PCR 檢測示NELL1 mRNA 陽性表達(dá)，熒光顯微鏡觀察示細(xì)胞爬片GFP 陽性表達(dá)，NELL1 抗體免疫熒光觀察示NELL1 蛋白陽性表達(dá)。CCK-8 法鑒定顯示轉(zhuǎn)染后對BMSCs生長無明顯影響。 結(jié)論 構(gòu)建并純化后的重組腺病毒載體（pAdxsi-GFP-NELL1）可高效轉(zhuǎn)染大鼠BMSCs，并穩(wěn)定表達(dá)NELL1 和GFP 兩種基因，為進(jìn)一步研究新的成骨基因NELL1 的作用，追蹤其在體內(nèi)、體外表達(dá)情況提供了新工具。
引用本文： 薛靜,彭江,張莉,劉舒云,陳繼鳳,汪愛媛,袁玫,許文靜,盧世璧. 綠色熒光蛋白和Nel1 型蛋白基因共表達(dá)腺病毒載體的構(gòu)建及體外轉(zhuǎn)染大鼠BMSCs 的初步實(shí)驗(yàn)研究. 中國修復(fù)重建外科雜志, 2010, 24(5): 606-612. doi: 復(fù)制