目的 構(gòu)建共表達增強型綠色熒光蛋白（enhanced green fluorescent protein，EGFP）基因和人胰島素（insulin）基因的慢病毒載體，探討其對人臍帶間充質(zhì)干細胞（human umbilical cord mesenchymal stem cells，hUCMSCs）的轉(zhuǎn)染情況，為今后組織工程脂肪構(gòu)建與體內(nèi)回植研究奠定基礎。 方法 采用DNA 重組技術(shù)，將insulin 基因克隆至帶EGFP 的慢病毒表達載體pLenti6.3- 內(nèi)部核糖體進入位點序列（internal ribosome entry site，IRES）-EGFP 中，篩選陽性克隆，并用脂質(zhì)體介導法將慢病毒包裝系統(tǒng)和帶目的基因的質(zhì)粒pLenti6.3-insulin-IRES-EGFP 共同轉(zhuǎn)染到293T 細胞內(nèi)包裝病毒，熒光倒置相差顯微鏡觀察包裝細胞報告基因的表達情況。收集病毒上清，純化濃縮，測定重組病毒的滴度。取足月兒臍帶以組織塊培養(yǎng)法分離培養(yǎng)hUCMSCs，以不同感染復數(shù)（multiple of infection，MOI，分別為0、1、3、5、7、10、15、20）的重組慢病毒感染hUCMSCs，通過報告基因綠色熒光蛋白的表達篩選最適MOI；以最適MOI 重組慢病毒感染hUCMSCs，應用實時熒光定量PCR 及Western blot 法分別檢測細胞中insulin 基因及insulin 蛋白水平的表達情況。 結(jié)果 成功構(gòu)建了共表達insulin 基因和EGFP 基因的重組慢病毒載體pLenti6.3-insulin-IRES-EGFP，并對其成功包裝、純化及濃縮，病毒滴度為1.3 × 108 TU/mL。不同MOI 的重組慢病毒感染hUCMSCs 后，通過綠色熒光蛋白表達的陽性細胞數(shù)篩選其最適MOI 為10，此時對細胞的轉(zhuǎn)染效率可達到90%。實時熒光定量PCR 檢測示轉(zhuǎn)染組insulin mRNA 表達陽性，未轉(zhuǎn)染組為陰性；Western blot 檢測示轉(zhuǎn)染組細胞內(nèi)及上清液insulin 蛋白表達陽性，未轉(zhuǎn)染組均為陰性。 結(jié)論 構(gòu)建的攜帶insulin基因的重組慢病毒載體pLenti6.3-insulin-IRES-EGFP 可有效轉(zhuǎn)染hUCMSCs，表達insulin 蛋白。

引用本文： 劉毅,薛美思. 攜帶人胰島素基因慢病毒載體轉(zhuǎn)染人臍帶間充質(zhì)干細胞的實驗研究. 中國修復重建外科雜志, 2010, 24(7): 822-827. doi: 復制