【摘 要】 目的 通過(guò)引入內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)序列（internal ribosome entry site，IRES），構(gòu)建帶有hVEGF165 及
hBMP-7 雙基因的重組腺相關(guān)病毒載體（adeno-associated virus，AAV），并對(duì)其進(jìn)行鑒定。 方法 以AAV 腺相關(guān)病毒
包裝系統(tǒng)（helper-free system）為基礎(chǔ)，將真核表達(dá)質(zhì)粒pIRES 中的IRES 片段定向克隆至腺相關(guān)病毒骨架質(zhì)粒pAAVMCS
中，形成含有IRES 序列及上、下游多克隆位點(diǎn)的重組骨架質(zhì)粒pAAV-MCS A-IRES-MCS B。PCR 擴(kuò)增hVEGF165 和
hBMP-7 基因，先后亞克隆入重組腺相關(guān)病毒骨架質(zhì)粒IRES 序列上、下游的多克隆位點(diǎn)，獲得重組質(zhì)粒pAAV-hVEGF165-
IRES-hBMP-7。將其和包裝質(zhì)粒pAAV-RC、輔助質(zhì)粒pHelper 三質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染AAV-293 細(xì)胞，包裝重組腺相關(guān)病毒rAAVhVEGF165-IRES-hBMP-7，同時(shí)包裝含有綠色熒光蛋白（green fluorescent protein，GFP）標(biāo)記的重組病毒rAAV-IRES-GFP作平行對(duì)照。熒光顯微鏡下監(jiān)測(cè)病毒包裝效率，收獲重組病毒后感染AAV-HT1080 細(xì)胞測(cè)定病毒滴度，并通過(guò)病毒基因
組外源基因擴(kuò)增鑒定重組病毒的包裝是否成功。 結(jié)果 重組腺相關(guān)病毒骨架質(zhì)粒pAAV-hVEGF165-IRES-hBMP-7 經(jīng)
雙酶切鑒定正確。熒光顯微鏡下觀察三質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染AAV-293 細(xì)胞72 h 后，病毒包裝效率達(dá)95% ～ 100%，收獲的重組病
毒具有較高濃度及活性，感染AAV-HT1080 效率達(dá)90%，熒光計(jì)數(shù)法測(cè)定病毒感染滴度達(dá)5.5 × 1011 vp/mL。提取重組病
毒基因組成功擴(kuò)增出外源目的基因hVEGF165 及hBMP-7 片段，重組病毒包裝成功。 結(jié)論 成功構(gòu)建帶有hVEGF165 及
hBMP-7 雙基因的重組腺相關(guān)病毒rAAV-hVEGF165-IRES-hBMP-7，收獲的病毒具有較高滴度，為今后利用腺相關(guān)病毒載體
進(jìn)行hVEGF165 及hBMP-7 雙基因共表達(dá)影響骨修復(fù)的體外及體內(nèi)研究提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
引用本文： 黃向輝,時(shí)志斌,王坤正,黨曉謙,楊佩,余鵬博. hVEGF165 及hBMP-7 雙基因共表達(dá)腺相關(guān)病毒載體的構(gòu)建及鑒定. 中國(guó)修復(fù)重建外科雜志, 2008, 22(7): 807-813. doi: 復(fù)制