目的 設(shè)計(jì)、構(gòu)建并篩選出轉(zhuǎn)染至人骨肉瘤細(xì)胞系OS-9901，對c-myc 沉默效果最佳的復(fù)制缺陷型重組腺病毒質(zhì)粒pAd-c-myc- 短發(fā)夾RNA（short hairpin RNA，shRNA）包裝出表達(dá)c-myc-shRNA 的重組腺病毒，并測定其滴度。 方法 設(shè)計(jì)有shRNA 結(jié)構(gòu)的3 對單鏈寡核苷酸（ss oligos），經(jīng)變性退火為雙鏈寡核苷酸（ds oligos），插入穿梭質(zhì)粒pENTR/U6 載體，測序正確后，經(jīng)LipofectamineTM2000 陽離子脂質(zhì)體介導(dǎo)入人骨肉瘤細(xì)胞系OS-9901，采用RTPCR篩選對c-myc 沉默效果最佳的穿梭質(zhì)粒pENTR/U6-shRNA，然后與腺病毒骨架質(zhì)粒行同源重組，篩選出正確重組子。采用293A 細(xì)胞包裝出表達(dá)c-myc-shRNA 的復(fù)制缺陷型重組腺病毒，觀察其細(xì)胞病變效應(yīng)（cytopathic effect，CPE），采用病毒顆粒法（viral particles，VP）和50% 組織培養(yǎng)感染劑量法（50% tissue culture infective dose，TCID50）測定病毒滴度。 結(jié) 果 電泳驗(yàn)證后的ds oligos 插入穿梭質(zhì)粒pENTR/U6 載體，測序結(jié)果提示構(gòu)建的pENTR/U6-shRNA 質(zhì)粒正確。從3 對ds oligos 通過RT-PCR 方法篩選出對c-myc 沉默效果最佳的穿梭質(zhì)粒pENTR/U6-shRNA，經(jīng)Pac Ⅰ酶切線性化后同源重組成功構(gòu)建了介導(dǎo)c-myc-shRNA 復(fù)制缺陷型重組腺病毒，CPE 和空泡現(xiàn)象 3 d 開始出現(xiàn)，6 d 更加明顯。采用VP法測定的第1 代腺病毒滴度為5.23 × 109 VP/mL，經(jīng)3 ～ 4 代擴(kuò)增后可達(dá)2.26 × 1012 VP/mL。TCID50 證實(shí)病毒滴度為10-3.8/0.1 mL。 結(jié)論 通過RNA 干擾技術(shù)，體外成功構(gòu)建了介導(dǎo)shRNA-c-myc 復(fù)制缺陷型重組腺病毒。
引用本文： 王棟琪,劉淼,王民,張銀剛. 沉默c-myc 重組腺病毒載體的構(gòu)建. 中國修復(fù)重建外科雜志, 2008, 22(8): 969-973. doi: 復(fù)制