目的 觀察家豬骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞 (marrow mesenchymal stem cells, MSCs) 在體外誘導(dǎo)條件下成骨分化的特征及相關(guān)基因的表達(dá)。方法 選取3月齡雌性長白豬6頭，無菌條件下于脛骨近端抽取骨髓15 ml。采用密度梯度離心法并根據(jù)細(xì)胞貼壁特性對MSCs進(jìn)行分離、純化，倒置相差顯微鏡觀察原代細(xì)胞生長情況，于培養(yǎng)第7天計算MSCs百分比含量及群體倍增值。將第1代細(xì)胞置于含1×10-8 mmol/L 地塞米松(dexamethasone, Dex)、10 mmol/Lβ-磷酸甘油(β-glycerophosphate, β-GP)和82 μg/ml 抗壞血酸(ascorbic acid, Asc)的成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)液中培養(yǎng)21 d，作為實驗組；DMEM培養(yǎng)液中培養(yǎng)作為對照組。分別行細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察、堿性磷酸酶 (alkaline phosphatase, ALP)組織化學(xué)染色、鈣沉積和細(xì)胞增殖測定，采用實時定量PCR分析成骨分化的相關(guān)基因表達(dá)。結(jié)果 原代MSCs特征：培養(yǎng)第1天，有核細(xì)胞大部分由懸浮的圓形血源性細(xì)胞組成；第3天換液棄除非貼壁細(xì)胞，MSCs克隆開始形成，細(xì)胞呈成纖維細(xì)胞樣生長；第7天，鏡下觀察到大小不一的克隆。細(xì)胞在培養(yǎng)后12～14 d基本長滿，原代細(xì)胞群體倍增值平均為13。MSCs成骨分化：誘導(dǎo)培養(yǎng)14 d實驗組細(xì)胞形態(tài)由成纖維細(xì)胞樣變成立方體樣，而對照組細(xì)胞始終保持成纖維細(xì)胞樣。培養(yǎng)5 d，對照組細(xì)胞計數(shù)為11 723±4 040，實驗組為10 276±5 513，二者差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。與對照組相比，實驗組誘導(dǎo)培養(yǎng)14 d，ALP染色呈強(qiáng)陽性，21 d鈣沉積明顯增加 (P＜0.01)。實驗組MSCs成骨相關(guān)基因：核心結(jié)合因子α1 (core binding factor α1, Cbfα1)、osterix、ALP、Ⅰ型膠原、骨連接素(osteonectin, ON)、骨鈣素(osteocalcin, OC)表達(dá)逐漸增強(qiáng)；Cbfα1、ALP、ON在分化早期增加明顯；與第7天比較，第21天osterix和OC基因表達(dá)明顯上調(diào) (P＜0.05)；第14天，Ⅰ型膠原表達(dá)也上調(diào) (P＜0.05)。結(jié)論 密度梯度離心法分離的豬MSCs，在體外誘導(dǎo)條件下能通過上調(diào)分化特異基因表達(dá)向成骨細(xì)胞分化。
引用本文： 鄒立津,呂農(nóng)華,馮文周,鄒學(xué)農(nóng). 體外誘導(dǎo)家豬骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化. 中國修復(fù)重建外科雜志, 2007, 21(11): 1222-1227. doi: 復(fù)制