目的 利用綠色熒光蛋白(green fluorescent protein，GFP)標(biāo)記技術(shù)，觀察組織工程骨在體內(nèi)形成過程中種子細(xì)胞的變化與轉(zhuǎn)歸。方法 Adeno-XTM-GFP擴(kuò)增和純化后，測定病毒滴度，感染新西蘭大白兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cells, MSCs），倒置相差顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)變化，并在熒光顯微鏡下觀察GFP表達(dá)情況。確認(rèn)標(biāo)記成功后，將其與未標(biāo)記的兔MSCs共同成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)3周后，接種于磷酸鈣骨水泥（calcium phosphate cement，CPC）纖維蛋白膠（fibrin glue，F(xiàn)G）復(fù)合支架材料，構(gòu)建組織工程骨作為實(shí)驗(yàn)組，回植于供體兔皮下。單純CPC-FG復(fù)合支架材料植入對(duì)稱部位作為對(duì)照。術(shù)后1、2、3周行堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)活性測定；4周，激光共聚焦顯微鏡下對(duì)GFP進(jìn)行示蹤觀察和Ⅰ型膠原、骨鈣素(osteocalcin，OC)免疫組織化學(xué)檢測成骨細(xì)胞功能蛋白，Masson染色觀察新骨形成。結(jié)果 Adeno-XTM-GFP經(jīng)擴(kuò)增和純化后，病毒噬菌斑形成，測得病毒滴度為3×10.8 pfu/ml。Adeno-XTM-GFP感染MSCs后96 h，可見GFP表達(dá)，感染率達(dá)50％～70%，細(xì)胞分裂增殖基本正常。術(shù)后1、2、3周，實(shí)驗(yàn)組ALP活性分別為12.546±1.091、16.567±0.659和20.443±0.706，對(duì)照組分別為0.453±0.113、0.243±0.018和0.308±0.056，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。4周，實(shí)驗(yàn)組大體可見組織工程新骨形成，對(duì)照組未見新骨形成；組織學(xué)顯示實(shí)驗(yàn)組新生骨小梁圍繞材料孔隙形成，CPCFG復(fù)合支架材料部分降解；實(shí)驗(yàn)組Ⅰ型膠原、OC免疫組織化學(xué)結(jié)果陽性，對(duì)照組未見陽性染色；實(shí)驗(yàn)組可見新生組織內(nèi)有GFP標(biāo)記的細(xì)胞。結(jié)論 組織工程骨組織結(jié)構(gòu)與松質(zhì)骨小梁類似，新生組織表達(dá)GFP，提示組織工程骨組織的形成來源于接種的細(xì)胞。

引用本文： 胡運(yùn)生,馬保安,李文海,張勇,范清宇. 綠色熒光蛋白標(biāo)記基因體內(nèi)示蹤骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分化. 中國修復(fù)重建外科雜志, 2007, 21(6): 633-637. doi: 復(fù)制