目的〓〖HTSS〗構(gòu)建重組人骨形成蛋白4（human bone morphogenetic protein 4, hBMP-4）基因腺相關(guān)病毒載體。方法根據(jù)hBMP-4的基因序列設(shè)計引物，上游引入EcoRⅠ位點，下游引入Sal Ⅰ位點，以EX-A0242-M01-hBMP-4為模板擴增目的基因。將hBMP4基因克隆入pUC18載體中，獲得重組質(zhì)粒pUC18-hBMP-4。然后用EcoRⅠ與SalⅠ酶切pUC18-hBMP-4及質(zhì)粒pSNAV，回收酶切片段，T4 DNA連接酶16℃過夜，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受肽細(xì)胞，篩選陽性克隆獲得pSNAV-hBMP-4，EcoRⅠ／SalⅡ雙酶切鑒定，并行全基因測序。轉(zhuǎn)染BHK21細(xì)胞，G418篩選培養(yǎng)，獲得抗藥克隆細(xì)胞株。HSV1rc/△UL2感染，包裝此細(xì)胞株并收獲病毒載體AAV-hBMP-4。行DNA點雜交法測定病毒滴度，SDS-PAGE分析判斷病毒純度。結(jié)果 PCR電泳及酶切鑒定表明，pSNAV-hBMP-4重組成功，基因測序顯示裝入pSNAV質(zhì)粒中的hBMP-4基因正確；AAV-hBMP-4病毒的大致滴度為1.5×10 12 μg/ml，分泌蛋白濃度為0.124 mg/ml，病毒載體純度在95%以上。結(jié)論 實驗獲得的病毒載體滴度高、感染性好，可以滿足骨組織工程的需要。
引用本文： 董智勇,鄭召民,鄺冠明,李佛保. 重組人骨形成蛋白4基因腺相關(guān)病毒載體的構(gòu)建. 中國修復(fù)重建外科雜志, 2007, 21(7): 738-742. doi: 復(fù)制