目的 探討在體電穿孔輔助基因轉(zhuǎn)染視網(wǎng)膜色素上皮（RPE）細(xì)胞層和光感受器（PR）細(xì)胞層的可行性。方法 147只健康雄性Spragne-Dawley(SD)大鼠根據(jù)電穿孔刺激模式電壓值分為5、10、15、20、25、30、35 V組，右眼視網(wǎng)膜下腔注射增強(qiáng)型綠色熒光蛋白（EGFP）真核表達(dá)質(zhì)粒pEGFPN1為實(shí)驗(yàn)眼，左眼注射TE Buffer 為對照眼。各組根據(jù)不同轉(zhuǎn)染方向再分為RPE和PR兩個(gè)亞組。各組除電壓不同外，其余參數(shù)均為脈寬99 ms，脈沖間期0.5 s，連續(xù)5個(gè)脈沖。將帶有負(fù)電荷的質(zhì)粒在電場作用下，擬轉(zhuǎn)染到RPE細(xì)胞層，反向置電極，擬轉(zhuǎn)染到PR細(xì)胞層。轉(zhuǎn)染后7 d 取各組視網(wǎng)膜鋪片，熒光顯微鏡下觀察EGFP表達(dá)強(qiáng)弱、范圍及熒光細(xì)胞計(jì)數(shù)分析；采用蛋白質(zhì)免疫印跡法（Western blot）、實(shí)時(shí)逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）半定量觀察EGFP蛋白和mRNA的表達(dá)。結(jié)果 轉(zhuǎn)染后7 d，熒光顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，各組RPE亞組對照眼RPE細(xì)胞層內(nèi)均未見特異性熒光表達(dá)，實(shí)驗(yàn)眼可見綠色熒光表達(dá)；各組RPE亞組對照眼視網(wǎng)膜鋪片均未見熒光表達(dá)，實(shí)驗(yàn)眼視網(wǎng)膜鋪片均可見轉(zhuǎn)染了EGFP的RPE細(xì)胞。Western blot檢測顯示，隨電壓增加，EGFP蛋白與 beta;-肌動(dòng)蛋白條帶灰度相對比值呈上升趨勢。RT-PCR檢測顯示，各組均產(chǎn)生陽性擴(kuò)增條帶，隨電壓增高，EGFP mRNA與GADPH mRNA擴(kuò)增條帶灰度相對比值逐漸增高。結(jié)論 在體電穿孔方法可以有效輔助基因轉(zhuǎn)染大鼠RPE細(xì)胞層。
引用本文： 張萌,莫曉芬,郭文毅,吳繼紅,方媛,張圣海,李希. 在體電穿孔輔助基因轉(zhuǎn)染視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞層和光感受器細(xì)胞層的實(shí)驗(yàn)研究. 中華眼底病雜志, 2010, 26(1): 61-65. doi: 復(fù)制
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