引用本文： 張仲斌, 高凱, 劉慶祝, 周家蓬, 李溪遠(yuǎn), 郎娜, 劉明, 王天爽, 張捷, 王惠, 董穎, 季濤云, 王爽, 劉曉燕, 姜玉武, 蔡立新, 吳曄. 局灶性皮質(zhì)發(fā)育不良 II 型腦組織中新候選基因的體細(xì)胞變異. 癲癇雜志, 2020, 6(4): 385-386. doi: 復(fù)制
背景 局灶性皮質(zhì)發(fā)育不良（Focal cortical dysplasia，F(xiàn)CD）是大腦發(fā)育過(guò)程中局部神經(jīng)元增殖及分化異常而導(dǎo)致的皮質(zhì)發(fā)育畸形，是兒童藥物難治性癲癇的常見(jiàn)病因，也是兒童癲癇外科癲癇病灶切除術(shù)的主要病理類(lèi)型。其中 FCD II 型占比最高，其病理主要表現(xiàn)為皮質(zhì)分層異常，存在異形神經(jīng)元，伴或不伴氣球樣細(xì)胞，進(jìn)一步分為 FCD IIa 和 FCD IIb。近十余年來(lái)，利用手術(shù)切除 FCD II 型腦組織樣本進(jìn)行深度二代測(cè)序，并與患者自身外周血或唾液細(xì)胞對(duì)照，在 10%～63% 的 FCD II 型患者的病灶腦組織中檢測(cè)到體細(xì)胞突變，突變基因所編碼的蛋白都位于哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白（mammalian Target of rapamycin，mTOR）通路及其調(diào)控通路上，包括 MTOR、PIK3CA、TSC1、TSC2、AKT3、RHEB 和 DEPDC5 等，在病灶組織中突變等位基因頻率為 0.93%～33.5%，突變均導(dǎo)致 PI3K-AKT-mTOR 通路上調(diào)。然而，既往研究中仍有約半數(shù) FCD II 型腦組織樣本中基因檢測(cè)陰性。本研究旨在發(fā)現(xiàn) FCD II 型腦組織中新的候選基因。
方法 收集 17 例藥物難治性癲癇患兒手術(shù)切除的 FCDII 型病灶區(qū)腦組織、灶旁區(qū)腦組織及外周血樣本，其中包括 FCD IIa 4 例、FCD IIb 13 例。分別對(duì)上述 3 類(lèi)樣本提取的 DNA 進(jìn)行全外顯子組測(cè)序（Whole exome sequencing，WES）（測(cè)序深度≥200×）。為了得到病灶組織中的可能有害變異（Potentially deleterious somatic variants，PDSVs），WES 數(shù)據(jù)進(jìn)一步根據(jù)如下策略逐層進(jìn)行篩選：① 篩選出 FCD II 型病灶中獨(dú)有的體細(xì)胞變異（灶旁腦組織及外周血均未檢測(cè)到變異）：病灶組織 DNA 中≥4 個(gè)獨(dú)立變異 reads，灶旁及外周血 DNA 變異 read 為 0；
② 篩選出腦內(nèi)表達(dá)基因：根據(jù) GTEx V7 數(shù)據(jù)庫(kù)，設(shè)定腦內(nèi)平均表達(dá)量>1 作為 cut-off 值；
③ 篩選出可疑有害變異：首先將非剪切位點(diǎn)內(nèi)含子變異及同義變異剔除，然后保留符合下述任何一條的變異：a. 錯(cuò)義變異（PolyPhen2、SIFT、MutationTaster，≥2 個(gè)致病性預(yù)測(cè)為有害）；b. 無(wú)義變異；c. 終止密碼子丟失變異；d. 插入缺失變異；e. 剪切位點(diǎn)變異；f. 收錄在 ClinVar、HGMD 和 Cosmic70 數(shù)據(jù)庫(kù)的變異，最后將保留下的變異中最小等位基因頻率（Minor allele frequency，MAF）>0.05 的變異剔除；
④ 為了將 WES 假陽(yáng)性結(jié)果最小化：將變異等位基因頻率<1% 的變異剔除；
⑤ 進(jìn)一步利用擴(kuò)增子測(cè)序方法（讀取深度≥8000×）對(duì) WES 數(shù)據(jù)篩選出的 PDSVs 進(jìn)行驗(yàn)證。最終保留 WES 和擴(kuò)增子測(cè)序變異變異等位基因頻率均≥1% 的變異作為最終 PDSVs。并利用 KEGG 通路數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)一步進(jìn)行通路富集分析。為了確定我們發(fā)現(xiàn)的胰島素受體底物 1（Insulin receptor substrate 1，IRS1）基因體細(xì)胞變異的致病意義，我們利用 HEK293T 細(xì)胞及 FCD II 型腦組織進(jìn)行了體外功能研究。
結(jié)果 在 6 例 FCDII 患兒（6/17，35.3%）的病灶腦組織中發(fā)現(xiàn)了 7 個(gè)基因中的 7 個(gè) PDSVs，包括 2 個(gè)移碼變異及 5 個(gè)錯(cuò)義變異，變異等位基因頻率 1.29%～5.5%。7 個(gè) PDSVs 分別為：MTOR（c.C5930A，p.Thr1977Lys，NM_004958.4）、TSC2（c.C5227T，p.Arg1743Trp，NM_000548.5）、IRS1 （c.1791dupG，p.His598Ala fs*13，NM_005544.2）、RAB6B （c.C383T，p.Thr128Met，NM_016577.4）、RALA （c.G482A，p.Arg161Gln，NM_005402.4）、HTR6 （c.G469A，p.Ala157Thr，NM_000871.3） 和 ZNF337 （c.692_693del；p.Thr231Arg fs*45，NM_001290261.1）。其中 IRS1、RAB6B、ZNF337、RALA 和 HTR6 尚未報(bào)道與任何皮質(zhì)發(fā)育畸形相關(guān)。IRS1 和 HTR6 的 PDSVs 已在 COSMIC 數(shù)據(jù)庫(kù)中報(bào)道，提示上述 2 個(gè)體細(xì)胞變異在其他腫瘤樣本中曾被發(fā)現(xiàn)。在發(fā)現(xiàn) PDSVs 的 6 例 FCD 病灶中，5 例僅檢測(cè)到 1 個(gè) PDSV，1 例（病例 1）病灶中同時(shí)檢測(cè)到 2 個(gè)基因（IRS1 和 ZNF337）的 2 個(gè) PDSVs。
經(jīng)過(guò)通路分析發(fā)現(xiàn)，IRS1、RAB6B、RALA 和 HTR6 均與 mTOR 通路存在相互作用。由于 IRS1 恰位于 PI3K-AKT-mTOR 通路上游，本研究選擇 IRS1 進(jìn)行了進(jìn)一步的功能研究。通過(guò)檢測(cè)轉(zhuǎn)染野生型或突變型 IRS1（c.1791dupG）HEK293T 細(xì)胞的 IRS1 蛋白表達(dá)，發(fā)現(xiàn) IRS1 c.1791dupG 導(dǎo)致蛋白截短，蛋白表達(dá)量無(wú)顯著變化。利用免疫印跡法及免疫熒光染色檢測(cè)病例 1（檢測(cè)到 IRS1 變異的患者）的病灶及灶旁腦組織 S6 磷酸化水平，證實(shí)該患兒病灶腦組織較灶旁組織的 mTOR 通路激活水平明顯升高，且主要分布在病灶組織的神經(jīng)元（包括異形神經(jīng)元）和氣球樣細(xì)胞中。進(jìn)一步通過(guò)檢測(cè)轉(zhuǎn)染野生型或突變型 IRS1 的 HEK293T 細(xì)胞 S6 磷酸化水平，證實(shí) IRS1 變異可導(dǎo)致 mTOR 通路異常激活。
結(jié)論 17 例 FCD II 型患兒中，6 例病灶腦組織檢測(cè)到 7 個(gè)基因的 7 個(gè) PDSVs，其中 5 個(gè)基因（IRS1、RAB6B、ZNF337、RALA、HTR6）尚未報(bào)道與皮質(zhì)發(fā)育畸形相關(guān)。體外功能研究證實(shí) IRS 基因變異可導(dǎo)致 mTOR 通路的過(guò)度激活。盡管需要進(jìn)一步功能學(xué)實(shí)驗(yàn)來(lái)證實(shí)上述 PDSVs 在 FCD II 型中的作用，但本研究結(jié)果為 FCD II 型發(fā)生機(jī)制提供了新的候選基因。
摘譯自：Zhang Z，Gao K，Liu Q， et al. Somatic variants in new candidate genes identified in focal cortical dysplasia type II. Epilepsia，2020，https://doi.org/10.1111/epi.16481.
背景 局灶性皮質(zhì)發(fā)育不良（Focal cortical dysplasia，F(xiàn)CD）是大腦發(fā)育過(guò)程中局部神經(jīng)元增殖及分化異常而導(dǎo)致的皮質(zhì)發(fā)育畸形，是兒童藥物難治性癲癇的常見(jiàn)病因，也是兒童癲癇外科癲癇病灶切除術(shù)的主要病理類(lèi)型。其中 FCD II 型占比最高，其病理主要表現(xiàn)為皮質(zhì)分層異常，存在異形神經(jīng)元，伴或不伴氣球樣細(xì)胞，進(jìn)一步分為 FCD IIa 和 FCD IIb。近十余年來(lái)，利用手術(shù)切除 FCD II 型腦組織樣本進(jìn)行深度二代測(cè)序，并與患者自身外周血或唾液細(xì)胞對(duì)照，在 10%～63% 的 FCD II 型患者的病灶腦組織中檢測(cè)到體細(xì)胞突變，突變基因所編碼的蛋白都位于哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白（mammalian Target of rapamycin，mTOR）通路及其調(diào)控通路上，包括 MTOR、PIK3CA、TSC1、TSC2、AKT3、RHEB 和 DEPDC5 等，在病灶組織中突變等位基因頻率為 0.93%～33.5%，突變均導(dǎo)致 PI3K-AKT-mTOR 通路上調(diào)。然而，既往研究中仍有約半數(shù) FCD II 型腦組織樣本中基因檢測(cè)陰性。本研究旨在發(fā)現(xiàn) FCD II 型腦組織中新的候選基因。
方法 收集 17 例藥物難治性癲癇患兒手術(shù)切除的 FCDII 型病灶區(qū)腦組織、灶旁區(qū)腦組織及外周血樣本，其中包括 FCD IIa 4 例、FCD IIb 13 例。分別對(duì)上述 3 類(lèi)樣本提取的 DNA 進(jìn)行全外顯子組測(cè)序（Whole exome sequencing，WES）（測(cè)序深度≥200×）。為了得到病灶組織中的可能有害變異（Potentially deleterious somatic variants，PDSVs），WES 數(shù)據(jù)進(jìn)一步根據(jù)如下策略逐層進(jìn)行篩選：① 篩選出 FCD II 型病灶中獨(dú)有的體細(xì)胞變異（灶旁腦組織及外周血均未檢測(cè)到變異）：病灶組織 DNA 中≥4 個(gè)獨(dú)立變異 reads，灶旁及外周血 DNA 變異 read 為 0；② 篩選出腦內(nèi)表達(dá)基因：根據(jù) GTEx V7 數(shù)據(jù)庫(kù)，設(shè)定腦內(nèi)平均表達(dá)量>1 作為 cut-off 值；③ 篩選出可疑有害變異：首先將非剪切位點(diǎn)內(nèi)含子變異及同義變異剔除，然后保留符合下述任何一條的變異：a. 錯(cuò)義變異（PolyPhen2、SIFT、MutationTaster，≥2 個(gè)致病性預(yù)測(cè)為有害）；b. 無(wú)義變異；c. 終止密碼子丟失變異；d. 插入缺失變異；e. 剪切位點(diǎn)變異；f. 收錄在 ClinVar、HGMD 和 Cosmic70 數(shù)據(jù)庫(kù)的變異，最后將保留下的變異中最小等位基因頻率（Minor allele frequency，MAF）>0.05 的變異剔除；④ 為了將 WES 假陽(yáng)性結(jié)果最小化：將變異等位基因頻率<1% 的變異剔除；⑤ 進(jìn)一步利用擴(kuò)增子測(cè)序方法（讀取深度≥8000×）對(duì) WES 數(shù)據(jù)篩選出的 PDSVs 進(jìn)行驗(yàn)證。最終保留 WES 和擴(kuò)增子測(cè)序變異變異等位基因頻率均≥1% 的變異作為最終 PDSVs。并利用 KEGG 通路數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)一步進(jìn)行通路富集分析。為了確定我們發(fā)現(xiàn)的胰島素受體底物 1（Insulin receptor substrate 1，IRS1）基因體細(xì)胞變異的致病意義，我們利用 HEK293T 細(xì)胞及 FCD II 型腦組織進(jìn)行了體外功能研究。
結(jié)果 在 6 例 FCDII 患兒（6/17，35.3%）的病灶腦組織中發(fā)現(xiàn)了 7 個(gè)基因中的 7 個(gè) PDSVs，包括 2 個(gè)移碼變異及 5 個(gè)錯(cuò)義變異，變異等位基因頻率 1.29%～5.5%。7 個(gè) PDSVs 分別為：MTOR（c.C5930A，p.Thr1977Lys，NM_004958.4）、TSC2（c.C5227T，p.Arg1743Trp，NM_000548.5）、IRS1 （c.1791dupG，p.His598Ala fs*13，NM_005544.2）、RAB6B （c.C383T，p.Thr128Met，NM_016577.4）、RALA （c.G482A，p.Arg161Gln，NM_005402.4）、HTR6 （c.G469A，p.Ala157Thr，NM_000871.3） 和 ZNF337 （c.692_693del；p.Thr231Arg fs*45，NM_001290261.1）。其中 IRS1、RAB6B、ZNF337、RALA 和 HTR6 尚未報(bào)道與任何皮質(zhì)發(fā)育畸形相關(guān)。IRS1 和 HTR6 的 PDSVs 已在 COSMIC 數(shù)據(jù)庫(kù)中報(bào)道，提示上述 2 個(gè)體細(xì)胞變異在其他腫瘤樣本中曾被發(fā)現(xiàn)。在發(fā)現(xiàn) PDSVs 的 6 例 FCD 病灶中，5 例僅檢測(cè)到 1 個(gè) PDSV，1 例（病例 1）病灶中同時(shí)檢測(cè)到 2 個(gè)基因（IRS1 和 ZNF337）的 2 個(gè) PDSVs。
經(jīng)過(guò)通路分析發(fā)現(xiàn)，IRS1、RAB6B、RALA 和 HTR6 均與 mTOR 通路存在相互作用。由于 IRS1 恰位于 PI3K-AKT-mTOR 通路上游，本研究選擇 IRS1 進(jìn)行了進(jìn)一步的功能研究。通過(guò)檢測(cè)轉(zhuǎn)染野生型或突變型 IRS1（c.1791dupG）HEK293T 細(xì)胞的 IRS1 蛋白表達(dá)，發(fā)現(xiàn) IRS1 c.1791dupG 導(dǎo)致蛋白截短，蛋白表達(dá)量無(wú)顯著變化。利用免疫印跡法及免疫熒光染色檢測(cè)病例 1（檢測(cè)到 IRS1 變異的患者）的病灶及灶旁腦組織 S6 磷酸化水平，證實(shí)該患兒病灶腦組織較灶旁組織的 mTOR 通路激活水平明顯升高，且主要分布在病灶組織的神經(jīng)元（包括異形神經(jīng)元）和氣球樣細(xì)胞中。進(jìn)一步通過(guò)檢測(cè)轉(zhuǎn)染野生型或突變型 IRS1 的 HEK293T 細(xì)胞 S6 磷酸化水平，證實(shí) IRS1 變異可導(dǎo)致 mTOR 通路異常激活。
結(jié)論 17 例 FCD II 型患兒中，6 例病灶腦組織檢測(cè)到 7 個(gè)基因的 7 個(gè) PDSVs，其中 5 個(gè)基因（IRS1、RAB6B、ZNF337、RALA、HTR6）尚未報(bào)道與皮質(zhì)發(fā)育畸形相關(guān)。體外功能研究證實(shí) IRS 基因變異可導(dǎo)致 mTOR 通路的過(guò)度激活。盡管需要進(jìn)一步功能學(xué)實(shí)驗(yàn)來(lái)證實(shí)上述 PDSVs 在 FCD II 型中的作用，但本研究結(jié)果為 FCD II 型發(fā)生機(jī)制提供了新的候選基因。
摘譯自：Zhang Z，Gao K，Liu Q， et al. Somatic variants in new candidate genes identified in focal cortical dysplasia type II. Epilepsia，2020，https://doi.org/10.1111/epi.16481.