目的探討抑制 miR-429 改善體外血脊髓屏障（blood spinal cord barrier，BSCB）通透性的可行性及機制，為改善脊髓微環(huán)境提供新的基因治療靶點。方法首先，取永生化人腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞系（hCMEC/D3），應(yīng)用 miR-429 拮抗劑 antagomiR-429 及其陰性對照 antagomiR-429-NC 進行轉(zhuǎn)染，通過熒光顯微鏡觀察以及實時熒光定量 PCR 檢測 miR-429 表達，驗證 antagomiR-429 轉(zhuǎn)染效率。然后觀察 miR-429 對體外 BSCB 通透性的影響。實驗分為 4 組，其中空白對照組（A 組）為正常 hCMEC/D3 細(xì)胞、Ha-sc 細(xì)胞構(gòu)建 BSCB 模型，低氧誘導(dǎo)組（B 組）、低氧誘導(dǎo)+antagomiR-429-NC 組（C 組）、低氧誘導(dǎo)+antagomiR-429 組（D 組）分別采用正常、antagomiR-429-NC 轉(zhuǎn)染以及 antagomiR-429 轉(zhuǎn)染的 hCMEC/D3 細(xì)胞，與 Ha-sc 細(xì)胞構(gòu)建 BSCB 模型并低氧處理 12 h。通過辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）通量測定體外 BSCB 通透性，實時熒光定量 PCR、Western blot 和免疫熒光染色觀測內(nèi)皮細(xì)胞中緊密連接蛋白 ZO-1、Occludin、Claudin-5 的表達水平。結(jié)果熒光顯微鏡下觀察 antagomiR-429 及 antagomiR-429-NC 成功轉(zhuǎn)染至 hCMEC/D3 細(xì)胞，轉(zhuǎn)染效率約為 90%；實時熒光定量 PCR 檢測 antagomiR-429 組 miR-429 相對表達量為 0.109±0.013，明顯低于 antagomiR-429-NC 組的 0.956±0.004（P<0.05）。HRP 通透性測量、實時熒光定量 PCR 及 Western blot 檢測顯示，B、C 組 HRP 通透性明顯高于 A、D 組，ZO-1、Occludin 和 Claudin-5 蛋白及 mRNA 相對表達量均明顯低于 A、D 組（P<0.05）；B、C 組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），D 組尚未達 A 組水平（P<0.05）。免疫熒光染色觀察示 D 組 ZO-1、Occludin 和 Claudin-5 蛋白在細(xì)胞膜邊界免疫熒光較 B、C 組增強，但尚未達 A 組強度。結(jié)論通過抑制 miR-429 表達可促進微血管內(nèi)皮細(xì)胞中 ZO-1、Occludin 和 Claudin-5 蛋白表達，進而改善因低氧導(dǎo)致的 BSCB 通透性增高。
目的 研究BMSCs 移植對大鼠脊髓損傷（spinal cord injury，SCI）后VEGF 受體胎肝激酶1（fetal liver kinase 1，F(xiàn)lk-1）基因和蛋白表達的影響，探討B(tài)MSCs 移植修復(fù)大鼠SCI 的機制。 方法 取4 周齡雄性Wistar 大鼠5 只，體重100 ～ 120 g，進行BMSCs 分離及培養(yǎng)。取81 只Wistar 雌性大鼠，體重220 ～ 250 g，采用改良Allen’s 打擊裝置制備SCI 模型，隨機分為3 組：假手術(shù)組（A 組，n=21），僅咬除T8 ～ 10 棘突和椎板；DMEM 組（B 組，n=30），SCI 區(qū)周圍注射DMEM；BMSCs 組（C 組，n=30），SCI 區(qū)周圍注射BMSCs。于移植術(shù)后1、3、5 d，采用RT-PCR 方法檢測各組大鼠SCI 區(qū)Flk-1 基因表達的變化；于移植術(shù)后3、7、14 d，免疫組織化學(xué)方法觀察脊髓內(nèi)Flk-1 蛋白的表達。 結(jié)果 原代培養(yǎng)的BMSCs 細(xì)胞形態(tài)多樣，隨著傳代次數(shù)的增加，細(xì)胞形態(tài)逐漸趨于均一，多為扁平形和長梭形。RT-PCR 結(jié)果顯示，在移植術(shù)后1、3、5 d，C 組Flk-1 mRNA 表達水平與B 組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P gt; 0.05）；但B、C 組與A 組比較，F(xiàn)lk-1 mRNA表達于術(shù)后1 d 明顯增加并達峰值（P lt; 0.01），術(shù)后3 d 下降（P lt; 0.01），至術(shù)后5 d 表達仍高于A組（P lt; 0.05）。免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示，移植術(shù)后3 、7 d，B 組Flk-1 蛋白表達較A 組顯著增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P lt; 0.01）；術(shù)后14 d，A、B 組Flk-1 蛋白表達差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P gt; 0.05） ；移植術(shù)后3 d，B、C 組Flk-1 表達相似，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P gt; 0.05），移植術(shù)后7 、14 d，C 組Flk-1 表達明顯高于B 組（P lt; 0.01）。 結(jié)論 SCI 后BMSCs 移植對Flk-1 mRNA 的表達無調(diào)節(jié)作用，但上調(diào)Flk-1 蛋白的表達，是修復(fù)SCI 的機制之一。
目的通過瞬時轉(zhuǎn)染缺氧誘導(dǎo)因子 1α（hypoxia-inducible factor 1α，HIF-1α）基因，觀察缺氧處理后人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞（human amniotic mesenchymal stem cells，hAMSCs）成活及凋亡情況，探討 HIF-1α 對 hAMSCs 耐受缺氧能力的影響。方法取健康剖宮產(chǎn)產(chǎn)婦自愿捐贈的羊膜組織分離、培養(yǎng) hAMSCs，通過倒置相差顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)及免疫熒光法檢測干細(xì)胞標(biāo)志物 OCT-4、NANOG 表達，對培養(yǎng)細(xì)胞進行鑒定。取第 3 代 hAMSCs 進行缺氧處理（200 μmol/L CoCl2）后，按以下分組瞬時轉(zhuǎn)染對應(yīng)質(zhì)粒：A 組為 hAMSCs 空白組，B 組為 pcDNA3.1 陰性對照組，C 組為 shRNA 陰性對照組，D 組為 shRNA-HIF-1α 干擾組，E 組為 pcDNA3.1-HIF-1α 過表達組。缺氧處理后 12、24、48 h 采用細(xì)胞計數(shù)試劑盒 8（cell counting kit 8，CCK-8）檢測各組細(xì)胞成活率；24 h 采用流式細(xì)胞儀檢測各組細(xì)胞凋亡率，并采用 Western blot 檢測 HIF-1α、VEGF、B 細(xì)胞淋巴瘤 2（B-cell lymphoma 2，Bcl-2）、Bax、活化型半胱天冬酶-3（cleaved Caspase-3，C-Caspase-3）蛋白表達。結(jié)果CCK-8 法檢測示，缺氧處理后各時間點與 A、C 組比較，D 組細(xì)胞成活率明顯降低（P<0.05）；與 A、B 組比較，E 組細(xì)胞成活率明顯升高，其中 24 h 組間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；E 組內(nèi) 24 h 時細(xì)胞成活率明顯高于 12、48 h 時（P<0.05）。流式細(xì)胞儀檢測示，與 A、C 組比較，D 組細(xì)胞凋亡率明顯升高（P<0.05）；與 A、B 組比較，E 組細(xì)胞凋亡率明顯降低（P<0.05）。Western blot 檢測示，與 A、C 組比較，D 組細(xì)胞中 HIF-1α、VEGF、Bcl-2 蛋白表達明顯減少，Bax、C-Caspase-3 蛋白表達明顯增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；而 E 組結(jié)果相反，與 A、B 組比較，E 組細(xì)胞中 HIF-1α、VEGF、Bcl-2 蛋白表達明顯增加，Bax、C-Caspase-3 蛋白表達明顯減少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)論HIF-1α 基因過表達能夠明顯改善 hAMSCs 耐受缺氧能力，其機制可能與上調(diào) VEGF 和 Bcl-2 表達及下調(diào) Bax 和 C-Caspase-3 表達作用相關(guān)。
目的 研究BMSCs 移植對大鼠脊髓損傷（spinal cord injury，SCI）后運動功能恢復(fù)、VEGF 基因表達和血管生成的影響，探討B(tài)MSCs 治療SCI 的機制。 方法 取5 只4 周齡Wistar 雄性大鼠骨髓，分離培養(yǎng)BMSCs，取第3 ～ 4 代細(xì)胞進行實驗。取Wistar 雌性成年大鼠87 只，體重220 ～ 250 g，隨機分為假手術(shù)組（A 組，21 只）、DMEM注射組（B 組，33 只）和BMSCs 移植組（C 組，33 只）。A 組僅咬除T8 ～ 10 棘突和椎板；B、C 組參照Nystrom 方法制備T8 ～ 10 SCI 模型，傷后30 min C 組注射BMSCs（共3.0 × 105 個），B 組注射等量DMEM。于術(shù)后3、7、14、28 d 采用Basso-Beattie-Bresnahan（BBB）評分法評價大鼠后肢運動功能；術(shù)后3、7、14、28 d 應(yīng)用Ⅷ因子免疫組織化學(xué)染色行微血管計數(shù)觀測血管生成情況；術(shù)后1、3、5 d 應(yīng)用RT-PCR 法檢測損傷脊髓組織內(nèi)VEGF mRNA 的表達。 結(jié)果 術(shù)后各時間點B、C 組大鼠后肢功能隨時間延長均有不同程度恢復(fù)，各時間點BBB 評分與A 組比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P lt; 0.05）。術(shù)后28 d，C 組BBB 評分顯著高于B 組（P lt; 0.05），其余時間點B、C 組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P gt; 0.05）。術(shù)后3 d，B、C 組損傷周圍區(qū)脊髓灰質(zhì)腹側(cè)角內(nèi)微血管數(shù)目明顯少于A 組（P lt; 0.05）；術(shù)后7、14、28 d 與A 組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P gt; 0.05）。C 組術(shù)后3、7 d 脊髓灰質(zhì)腹側(cè)角內(nèi)微血管數(shù)目與B 組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P gt; 0.05）；但術(shù)后14、28 d 顯著高于B 組（P lt; 0.05）。各組術(shù)后各時間點損傷周圍區(qū)脊髓白質(zhì)內(nèi)的微血管數(shù)目比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P gt; 0.05）。RTPCR檢測示，A 組大鼠脊髓組織內(nèi)VEGF mRNA 表達水平較低。B、C 組與A 組相比，于術(shù)后1 d 開始VEGF mRNA 表達增加，3 d 時表達達峰值，5 d 時表達下降但仍高 于A 組，各時間點與A 組比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P lt; 0.05）；C 組各時間點均高于B 組（P lt; 0.05）。 結(jié)論 BMSCs 可能通過上調(diào)VEGF 基因表達和增加脊髓內(nèi)新生血管而促進大鼠SCI 后運動功能恢復(fù)。
目的 氨基胍（aminoguanidine，AG）能顯著減輕腦外傷及中風(fēng)動物模型腦水腫，提高神經(jīng)功能恢復(fù)程度。探討AG對大鼠急性脊髓損傷（spinal cord injury，SCI）后脊髓水腫的作用及相關(guān)機制。 方法 取成年雄性SD大鼠150只（體重230～255 g），分為對照組（A組，25只）、假損傷組（B組，25只）、SCI后未治療組（C組，25只）和SCI后AG治療組（75只）；AG治療組按給藥劑量分為AG 75 mg/kg組（D組，25只）、AG 150 mg/kg組（E組，25只）和AG 300 mg/kg組（F組，25只）。A組未行任何處理，B組僅行椎板切除術(shù)但不治療；C、D、E、F組制備靜壓型大鼠SCI模型后，C組腹腔注射5%DMSO，D、E、F組腹腔注射相應(yīng)劑量AG。于造模后0、12、24、48 h用干濕重法檢測受損脊髓組織含水量以篩選最佳劑量，進一步用伊文思蘭（Evans blue，EB）法評測血-脊髓屏障功能，用RT-PCR檢測水通道蛋白4（aquaporins 4，AQP4）mRNA表達，Western blot和免疫組織化學(xué)染色檢測AQP4蛋白表達。 結(jié)果脊髓組織含水量檢測示，E組在造膜后12、24、48 h對SCI后脊髓組織水腫有明顯抑制作用（P lt; 0.05），選擇該劑量組用于后續(xù)實驗。造模后12、24、48 h，E組EB含量明顯低于C組（P lt; 0.05），降低血-脊髓屏障通透性。RT-PCR檢測結(jié)果示造模后12、24、48 h，B、E組AQP4 mRNA表達明顯低于C組；Western blot檢測示造模后24、48 h，B、E組AQP4蛋白表達明顯低于C組；免疫組織化學(xué)染色示造模后48 h，B、E組AQP4蛋白表達明顯低于C組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P lt; 0.05）；但各指標(biāo)各時間點B、E組間比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P gt; 0.05）。 結(jié)論急性SCI后大鼠經(jīng)150 mg/kg AG治療后，能降低AQP4表達，改善脊髓水腫，減輕損傷。