目的通過對(duì)半胱氨酸蛋白酶3（Caspase3）大、小亞基的重組，構(gòu)建pcDNA3.1(+)/rCaspase3真核表達(dá)質(zhì)粒,并探討rCaspase3基因誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的可能性，以尋求腫瘤基因治療的新途徑。方法采用分子生物學(xué)方法克隆Caspase3的大、小亞基，并在體外進(jìn)行重新排列組合，使大、小亞基原來的排序顛倒，構(gòu)建出pcDNA3.1(+)/rCaspase3真核表達(dá)質(zhì)粒； 脂質(zhì)體瞬時(shí)轉(zhuǎn)染人胰腺癌細(xì)胞PCⅡ,RTPCR檢測(cè)rCaspase3 mRNA的表達(dá)； 流式細(xì)胞技術(shù)（FCM）檢測(cè)轉(zhuǎn)染胰腺癌細(xì)胞凋亡狀況。結(jié)果Caspase3的大、小亞基被完整克隆，pcDNA3.1(+)/rCaspase3真核表達(dá)質(zhì)粒測(cè)序結(jié)果證實(shí)小亞基位于大亞基之前； RTPCR擴(kuò)增出894 bp大小片段，流式細(xì)胞檢測(cè)可見明顯的凋亡峰出現(xiàn)。結(jié)論構(gòu)建的rCaspase3其mRNA可在胰腺癌細(xì)胞中表達(dá)并自催化誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，可作為胰腺癌基因治療的目的基因。
目的 構(gòu)建肝細(xì)胞肝癌特異性表達(dá)反向半胱氨酸蛋白酶3（r-Caspase-3）重組腺病毒，為肝細(xì)胞肝癌的基因治療提供新策略。方法 構(gòu)建甲胎蛋白（AFP）增強(qiáng)子和白蛋白 (ALB) 啟動(dòng)子腺病毒載體（pAdTrack-EAFP-PALB），然后將目的基因r-Caspase-3亞克隆到載體pAdTrack-EAFP-PALB上， 獲得重組腺病毒穿梭載體pAdTrack-EAFP-PALB /r-Caspase-3, 經(jīng)PmeⅠ酶切線性化后與pAdEasy-1同源重組，獲得重組腺病毒骨架pAdEasy-EAFP-PALB /r-Caspase-3； 鑒定正確的pAdEasy-EAFP-PALB/r-Caspase-3 經(jīng)PacⅠ酶切線性化后脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染AD293 細(xì)胞進(jìn)行包裝、擴(kuò)增，獲得病毒。綠色熒光蛋白(green fluorescent protein，GFP)監(jiān)測(cè)病毒滴度和感染效率； RT-PCR和Western blot 法檢測(cè)r-Caspase-3在HepG2細(xì)胞中的表達(dá)； SRB染色法評(píng)估重組腺病毒對(duì)HepG2細(xì)胞的抑制作用，初步觀察HepG2細(xì)胞凋亡狀況。結(jié)果 穿梭載體pAdTrack-EAFP-PALB/r-Caspase-3酶切、測(cè)序正確。穿梭載體、pAdEasy-1載體同源重組后PCR 及PacⅠ酶切鑒定結(jié)果表明pAdEasy-EAFP-PALB/r-Caspase-3 重組成功； 經(jīng)PacⅠ酶切線性化后，pAdEasy-EAFP-PALB/r-Caspase-3 轉(zhuǎn)染AD293 細(xì)胞即可觀察到GFP 的表達(dá)； 回收病毒可重復(fù)感染AD293 細(xì)胞，RT-PCR和Western blot 均可檢測(cè)到r-Caspase-3的表達(dá)，證實(shí)Ad-EAFP-PALB/r-Caspase-3病毒顆粒包裝成功； SRB染色檢測(cè)發(fā)現(xiàn)Ad-EAFP-PALB/r-Caspase-3具有凋亡誘導(dǎo)特異性。結(jié)論 靶向性Ad-EAFP-PALB/r-Caspase-3重組腺病毒構(gòu)建成功，并具有凋亡誘導(dǎo)靶向性，為進(jìn)一步研究靶向性r-Caspase-3基因治療肝細(xì)胞肝癌及其生物學(xué)功能奠定了基礎(chǔ)。