目的 建立2型糖尿病大鼠后肢缺血模型并進(jìn)行評(píng)價(jià)，為后續(xù)的干預(yù)實(shí)驗(yàn)提供研究平臺(tái)。方法 將15只SD大鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組、糖尿病組及糖尿病后肢缺血組，每組5只。糖尿病組及糖尿病后肢缺血組的10只大鼠均給予高脂飲食喂養(yǎng)4周后，腹腔注射鏈脲佐菌素（STZ，40 mg/kg）以建立2型糖尿病模型。糖尿病后肢缺血組大鼠建模成功后行雙側(cè)髂總動(dòng)脈結(jié)扎術(shù)以建立后肢缺血模型，正常對(duì)照組和糖尿病組大鼠僅分離髂總動(dòng)脈，不予結(jié)扎。2周后對(duì)3組大鼠股動(dòng)脈的起始段行彩色多普勒超聲檢查，以檢測股動(dòng)脈的血流峰值速度和血流加速時(shí)間；取缺血部位的小腿三頭肌及大腿股四頭肌組織，分別行HE染色及免疫組化SP染色，以觀察3組大鼠肌細(xì)胞的營養(yǎng)狀況及血管再生情況。結(jié)果 后肢缺血模型建模2周后，正常對(duì)照組、糖尿病組和糖尿病后肢缺血組大鼠的血流峰值速度分別為（22.49±3.02） cm/s、（17.36±2.60） cm/s和（11.23±1.26） cm/s，血流加速時(shí)間分別為（0.080±0.009） s、（0.120±0.009） s和（0.160±0.020） s，糖尿病后肢缺血組大鼠的股動(dòng)脈血流峰值速度小于正常對(duì)照組和糖尿病組（P＜0.05），而血流加速時(shí)間較長（P＜0.05）。HE染色結(jié)果顯示：糖尿病后肢缺血組大鼠小腿三頭肌的結(jié)構(gòu)破壞，有大量炎癥細(xì)胞浸潤，肌肉損傷程度重于正常對(duì)照組和糖尿病組。免疫組化SP染色結(jié)果顯示：糖尿病后肢缺血組大鼠大腿股四頭肌的毛細(xì)血管密度〔（1.40±0.55） 個(gè)/HPF〕小于正常對(duì)照組 〔（6.80±0.84） 個(gè)/HPF〕及糖尿病組〔（4.60±0.55）個(gè)/HPF〕，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)論 對(duì)SD大鼠給予高脂飲食聯(lián)合小劑量STZ注射可以成功誘導(dǎo)2型糖尿病模型，在此模型基礎(chǔ)上結(jié)扎髂總動(dòng)脈可以成功制備糖尿病后肢缺血模型。
目的 利用細(xì)胞示蹤技術(shù)探討骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（MSCs）治療慢性后肢缺血的相關(guān)機(jī)理。方法 采用密度梯度離心法結(jié)合直接貼壁法分離和培養(yǎng)大鼠MSCs，并以5-溴脫氧尿嘧啶核苷（BrdU）標(biāo)記。采用線栓法制備8只Lewis大鼠慢性后肢缺血模型，將其隨機(jī)均分為MSCs移植組和對(duì)照組，分別于患側(cè)后肢肌肉注射MSCs和生理鹽水。分別于移植術(shù)后第7天和第14天，對(duì)其進(jìn)行臨床觀察、后肢血流量測定及后肢血管造影，再于相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)處死大鼠，取患側(cè)后肢股四頭肌和腓腸肌，行HE染色及BrdU免疫組化染色。結(jié)果 移植術(shù)后14d，8只大鼠全部成活，移植部位均無壞死和腫瘤形成；MSCs移植組大鼠患側(cè)/健側(cè)后肢的血流灌注比值明顯增高（1.773比1.279），而血管造影結(jié)果提示2組大鼠的側(cè)支血管數(shù)量比值未見顯著增加（0.908比0.835）。HE染色結(jié)果示2組大鼠的股四頭肌及腓腸肌并未發(fā)生特殊的病理學(xué)變化。BrdU免疫組化結(jié)果顯示，陽性顆粒定位為股四頭肌及腓腸肌的間質(zhì)細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞；且MSCs的分布存在差異，移植術(shù)后7d腓腸肌內(nèi)陽性細(xì)胞所占比例明顯高于股四頭肌，而14d時(shí)則相反。結(jié)論 MSCs移植在術(shù)后早期可以提高血流灌注量，但這并非為增加了側(cè)支血管數(shù)量使然，MSCs移植后所引起的旁分泌效應(yīng)可能在術(shù)后早期起著重要的作用。
目的 探討生肌玉紅膠原在缺血組織中促進(jìn)血管新生的作用效果及其作用機(jī)理。方法 Wistar大鼠48只按隨機(jī)配對(duì)方法隨機(jī)均分為空白組、對(duì)照組（膠原）及實(shí)驗(yàn)組（生肌玉紅膠原）3組；在大鼠后肢缺血模型基礎(chǔ)上于大鼠右后肢缺血組織中植入不同的膠原制劑，分別于模型制作術(shù)后3，7、14及28d取埋植的膠原制劑標(biāo)本及標(biāo)本周圍約0.5cm 范圍的缺血肌肉組織。通過激光散斑成像系統(tǒng)觀察大鼠右后肢缺血模型制作術(shù)后各時(shí)點(diǎn)的血流灌注情況，采用光度計(jì)法測定膠原制劑（生肌玉紅膠原）內(nèi)的血紅蛋白含量，采用免疫組化染色方法檢測標(biāo)本周圍肉芽組織中的微血管計(jì)數(shù)，采用實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR 方法檢測缺血肌肉組織中各時(shí)點(diǎn)低氧誘導(dǎo)因子（HIF）-1αmRNA以及血管內(nèi)皮生長因子（VEGF） mRNA的表達(dá)。結(jié)果 大鼠右后肢缺血模型制作成功即刻大鼠患肢呈現(xiàn)明顯的缺血狀態(tài)，其血流灌注值明顯低于術(shù)前（P ＜0.01）；在術(shù)后3d卻呈明顯的充血狀態(tài)，其血流灌注值明顯升高，且略高于術(shù)前水平，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＞0.05）；在術(shù)后7～14d大鼠患肢的血流灌注值呈逐漸下降趨勢，至術(shù)后28d又開始回升， 該3個(gè)時(shí)點(diǎn)實(shí)驗(yàn)組大鼠患肢的血流灌注值均高于空白組（P ＜0.05）， 對(duì)照組與空白組比較其差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＞0.05）；術(shù)后7及14d實(shí)驗(yàn)組大鼠肢體的血流灌注值高于對(duì)照組（P ＜0.05）。各時(shí)點(diǎn)實(shí)驗(yàn)組膠原標(biāo)本內(nèi)血紅蛋白含量均高于對(duì)照組 （P ＜0.01）。實(shí)驗(yàn)組微血管計(jì)數(shù)于術(shù)后7及14d高于對(duì)照組（P ＜0.05）； 實(shí)驗(yàn)組術(shù)后各時(shí)點(diǎn)HIF-1α mRNA及VEGF mRNA的表達(dá)水平均高于對(duì)照組和空白組（P ＜0.05），而對(duì)照組與空白組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＞0.05）。結(jié)論 生肌玉紅膠原通過誘導(dǎo)HIF-1α mRNA及VEGF mRNA血管新生相關(guān)基因的表達(dá)而改善缺血組織的血流灌注，促進(jìn)微血管新生，從而達(dá)到促進(jìn)組織修復(fù)的功效。
目的應(yīng)用激光多普勒血流探測儀(LDF)和激光多普勒血流成像儀(LDPI)監(jiān)測Lewis大鼠后肢急性缺血模型血流和血壓的動(dòng)態(tài)變化，探討大鼠后肢急性缺血后血流變化特點(diǎn)。方法切除大鼠左后肢股動(dòng)脈制備急性后肢缺血模型，于術(shù)后2、7、14、28及49 d對(duì)手術(shù)側(cè)和非手術(shù)側(cè)肢體采用LDF進(jìn)行血流、血壓檢測，于術(shù)后7 d采用LDPI進(jìn)行血流檢測。結(jié)果所有大鼠術(shù)后均成活，未發(fā)現(xiàn)后肢壞死; 在術(shù)后14 d內(nèi)手術(shù)側(cè)后肢平均分為2分，在49 d平均分為1分。大鼠手術(shù)側(cè)和非手術(shù)側(cè)肢體血流比值在術(shù)后2 d由術(shù)前的1上升至1.31±0.439(P=0.021),術(shù)后7 d和14 d分別為0.82±0.538和0.93±0.294，兩者比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.502)，但均明顯低于術(shù)后2 d的值(P=0.032和P=0.019); 術(shù)后28 d下降到最低點(diǎn)(0.41±1.970)，明顯低于術(shù)后2、7和14 d值(P=0.004、P=0.007和P=0.006); 在術(shù)后49 d手術(shù)側(cè)后肢血流恢復(fù)到接近術(shù)前值(0.98±0.093)，明顯低于術(shù)后2 d（P=0.010）而高于術(shù)后28 d值(P=0.005)，與術(shù)后7 d和14 d的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.126和P=0.382)。大鼠手術(shù)側(cè)和非手術(shù)側(cè)肢體血壓比值術(shù)后2 d由術(shù)前的1明顯下降至0.47±0.375(P=0.031); 術(shù)后7 d繼續(xù)下降至0.44±0.118，與術(shù)后2 d比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.203); 術(shù)后14 d下降到最低點(diǎn)(0.35±0.115)，明顯低于術(shù)后2 d和7 d值(P=0.001和P=0.036); 術(shù)后28 d開始上升(0.54±0.146)，明顯高于術(shù)后14 d值(P=0.008)，但與術(shù)后2 d(P=0.493)和7 d(P=0.551)的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義; 術(shù)后49 d恢復(fù)接近術(shù)前值(0.97±0.094)，明顯高于術(shù)后2、7、14和28 d值(P=0.013、P=0.021、P=0.002和P=0.031)。結(jié)論切除大鼠后肢股動(dòng)脈及分支的方法制備后肢急性缺血模型，在術(shù)后14~28 d患肢缺血處于最嚴(yán)重階段。LDF和LDPI可以動(dòng)態(tài)監(jiān)測肢體血流及血壓的變化，對(duì)監(jiān)測大鼠后肢術(shù)后缺血的動(dòng)態(tài)演變過程有著重要的作用。
目的研究外源性胰島素對(duì)糖尿病大鼠缺血后肢血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)表達(dá)的影響及其促血管新生的作用。方法取20只健康雄性SD大鼠,將其右后肢股動(dòng)、靜脈及其分支和屬支結(jié)扎，制成糖尿病大鼠后肢缺血模型，然后將其用簡單隨機(jī)化方法隨機(jī)平均分為模型組與治療組，另取10只正常大鼠作為對(duì)照組。14 d后處死大鼠，應(yīng)用 Western blot法檢測大鼠后肢肌肉組織中VEGF蛋白表達(dá)水平，并采用堿性磷酸酶(AKP)染色法測定大鼠后肢肌肉組織中毛細(xì)血管密度。結(jié)果對(duì)照組大鼠術(shù)前和術(shù)后7 d體重和血糖水平比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Pgt;0.05); 模型組大鼠術(shù)后7 d與術(shù)前比較，體重明顯下降(Plt;0.05)，但血糖水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Pgt;0.05); 而治療組給予皮下注射胰島素注射液術(shù)后7 d較術(shù)前體重明顯下降，并且血糖水平較術(shù)前也明顯下降，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Plt;0.05)。與對(duì)照組比較，治療組及模型組大鼠術(shù)后7 d體重明顯下降、血糖明顯升高(Plt;0.05，Plt;0.01); 治療組與模型組比較，體重差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Pgt;0.05)，但治療組大鼠術(shù)后7 d血糖水平較模型組明顯降低(Plt;0.05)。治療組大鼠缺血肢體肌肉組織中VEGF蛋白相對(duì)表達(dá)量(155.06±10.26)明顯高于模型組(94.30±11.23)，Plt;0.05; 對(duì)照組大鼠未檢測到VEGF蛋白表達(dá)。對(duì)照組大鼠右后肢肌肉組織中毛細(xì)血管密度明顯高于模型組和治療組(Plt;0.05)，而治療組又明顯高于模型組(Plt;0.05)。3組大鼠左后肢毛細(xì)血管密度差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Pgt;0.05); 對(duì)照組大鼠左、右后肢毛細(xì)血管密度差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Pgt;0.05); 模型組和治療組大鼠右后肢毛細(xì)血管密度均明顯低于左后肢(Plt;0.05)。結(jié)論胰島素可以增強(qiáng)糖尿病大鼠后肢缺血肌肉組織中VEGF蛋白表達(dá)，促進(jìn)毛細(xì)血管生成，發(fā)揮保護(hù)作用。
目的 探討經(jīng)肌肉注射轉(zhuǎn)染pEGFP-C1/Akt的鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（MSCs）對(duì)后肢缺血大鼠血管生成的影響。方法 Wistar大鼠30只，制成雙后肢缺血模型，雙盲法隨機(jī)分為基因治療組（肌注經(jīng)pEGFP-C1/Akt轉(zhuǎn)染的MSCs）、非基因治療組（肌注MSCs）及對(duì)照組（肌注PBS液）。造模前、造膜后即刻及MSCs移植后1~7 d內(nèi),每天用紅外線皮溫儀測定大鼠后肢皮溫變化。28 d時(shí)經(jīng)動(dòng)脈造影觀察后肢血管生成情況； 免疫組化染色檢測后肢毛細(xì)血管密度； 逆轉(zhuǎn)錄-多聚酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）和Western blot法檢測后肢肌肉組織中Akt及血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子（VEGF）的 mRNA和蛋白的表達(dá)。結(jié)果 移植3 d后基因治療組大鼠后肢皮溫升高明顯。28 d時(shí)經(jīng)動(dòng)脈造影觀察基因治療組后肢側(cè)支血管生成明顯； 熒光顯微鏡觀察有綠色熒光細(xì)胞在基因治療組的內(nèi)收肌和半膜肌分布。毛細(xì)血管密度： 基因治療組為（7.1±0.3）個(gè)/高倍鏡，非基因治療組為（4.2±0.4）個(gè)/高倍鏡，對(duì)照組為（1.3±0.2）個(gè)/高倍鏡，各組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。Akt及VEGF的 mRNA和蛋白的表達(dá)分析: 基因治療組Akt mRNA(2.44±0.14)和蛋白（1.12±0.13）及VEGF mRNA（1.11±0.11）和蛋白（0.97±0.13）表達(dá)水平均明顯高于非基因治療組Akt mRNA(1.58±0.13)和蛋白（0.78±0.12）及VEGF mRNA（0.78±0.14）和蛋白（0.67±0.11）以及對(duì)照組Akt mRNA(0.64±0.11)和蛋白（0.36±0.12）及VEGF mRNA（0.56±0.11）和蛋白（0.33±0.13）的表達(dá)水平（P＜0.01），后2組間比較差異亦均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。結(jié)論 pEGFP-C1/Akt體外轉(zhuǎn)染骨髓MSCs促進(jìn)后肢缺血大鼠血管生成的效果優(yōu)于單純MSCs治療，為基因轉(zhuǎn)染MSCs治療缺血性疾病提供可能。