目的克隆人血管內皮生長因子(hVEGF)基因VEGF165片段,構建pcDNA3.1/hVEGF165, 觀察其在COS-7細胞中的表達,為基因治療缺血性心臟病的研究奠定基礎。方法從合法引產的胎兒心肌組織中提取總核糖核酸(RNA),應用逆轉錄-聚合酶鏈反應(RT-PCR)方法獲得hVEGF165基因,將其重組入T載體,聚合酶鏈反應(PCR)法鑒定并測序,雙酶切后克隆入真核表達載體pcDNA3.1/myc-his-B中,構建pcDNA3.1/hVEGF165重組體。用脂質體介導將其轉染COS-7細胞,蛋白印跡(Westernblotting)法檢測rhVEGF165的表達蛋白。結果用RT-PCR方法從胎兒心肌組織中獲得了正確的hVEGF165基因序列,并成功構建pcDNA3.1/hVEGF165,且實現轉染COS-7細胞的瞬時表達。結論構建的pcDNA3.1/hVEGF165轉染真核細胞COS-7能夠表達rhVEGF蛋白。
目的 通過基因工程手段從大鼠脊髓中獲取Nogo-66、NEP1-40基因并實現其蛋白的體外表達。 方法 從幼年大鼠的脊髓組織中，通過RT-PCR技術獲得Nogo-66、 NEP1-40基因，將目的基因通過基因連接反應與T載體連接，重組質粒進行基因序列測序，構建PQE30-GST和目的基因的高表達質粒，異丙基βD硫代半乳糖(isopropylthiogalactoside,IPTG)誘導表達，Ni柱純化，Western-blot法檢測純化的目的蛋白。 結果 成功獲得大鼠Nogo-66、NEP1-40基因，加上兩端的酶切位點和保護性堿基，大小分別為215 bp和137 bp。序列測序顯示基因突變率為0，表達質粒構建雙酶切(BamH Ⅰ-和Hind Ⅲ)可見目的基因的條帶，經IPTG誘導表達，獲得帶GST標簽的融合蛋白Nogo-66和NEP1-40，相對分子質量分別為33.2×103和30.3×103。蛋白純化結果理想，經Westernblot分析證實抗原性正確。 結論 Nogo-66、NEP1-40蛋白可通過基因工程手段獲得體外高效表達，這將對其功能的研究及脊髓損傷疫苗的研究提供基礎。
目的 探討構建人骨形成蛋白2（human bone morphgenetic protein 2，hBMP-2）真核表達載體的方法。 方法 由人成骨肉瘤細胞中提取細胞總RNA，利用RT-PCR方法擴增獲得hBMP-2基因cDNA，將基因片斷重組到pGEM-T質粒中構建pGEMT- hBMP-2重組質粒載體，轉化到大腸桿菌DH5α后篩選陽性克隆，利用限制性酶切和DNA序列分析鑒定重組質粒。分別用EcoR Ⅰ和Not Ⅰ雙酶切pGEM-T- hBMP-2 質粒和pcDNA3.1(+)真核表達載體，將克隆載體中hBMP基因重組到pcDNA3.1(+)真核表達載體 ，提取質粒作酶切電泳、PCR鑒定及DNA測序。 結果 人骨肉瘤細胞中經RT-PCR得到1.2 kbp的hBMP-2擴增條帶，重組質粒pGEM-T-hBMP-2經酶切電泳可見1.2 kbp的hBMP-2條帶和4.0 kbp的載體片斷；pcDNA3.1-hBMP-2 質粒經酶切電泳可見1.2 kbp的hBMP2條帶和5.0 kbp的載體片斷，重組質粒酶譜分析與預期一致；DNA序列分析測序結果校對后經BLAST分析，表明核酸序列與Gene Bank中和hBMP-2 的mRNA序列完全吻合。 結論 通過此方法能成功克隆獲得hBMP-2基因，并構建其真核表達載體。
目的 構建β淀粉樣前體蛋白裂解酶（βsite amyloid precursor protein cleaving enzyme, BACE）基因的真核表達載體，為修復阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease, AD)損傷神經元奠定基礎。方法 采用RT-PCR 方法，從人的成神經細胞瘤的總cDNA中，擴增出1.5 kb 的BACE cDNA片段，再用BamHI和XhoI雙酶切后定向克隆到真核細胞表達載體pcDNA3.1中，用限制性內切酶酶切分析和DNA序列分析鑒定重組質粒；以免疫細胞化學法檢測BACE基因的表達情況。結果 人BACE基因的cDNA已克隆到真核細胞表達載體pcDNA3.1質粒中；經脂質體轉染COS-7細胞后，并由潮霉素進行篩選，可見轉染細胞胞漿中和胞膜上有較高量的BACE蛋白表達。結論 成功構建了pcDNA3.1-BACE的真核表達載體，為研究BACE基因在AD發(fā)病機制中的作用及抑制BACE，為治療AD奠定一定的實驗基礎。
目的 構建人堿性成纖維細胞生長因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)真核表達質粒，研究其在體內外的表達。方法 通過基因克隆技術，構建并大量制備pcDNA3.1/myc-His(-)C-bFGF真核表達體系，RT-PCR和細胞免疫組織化學方法檢測體外瞬時表達情況；直流電脈沖介導重組質粒pcDNA3.1/myc-His(-)C-bFGF和pCD2-血管內皮細胞生長因子121(vascular endothelial growth factor, VEGF121)在兔頸部肌肉瓣內轉移并表達，測定其促血管生成的生物學效應。結果 構建的pcDNA3.1/myc-His(-)C-bFGF真核表達體系成功轉染體外培養(yǎng)HeLa細胞，目的基因在mRNA水平和蛋白水平均有表達。pcDNA3.1/myc-His(-)C-bFGF和pCD2-VEGF121重組質粒分別轉染在體肌瓣，獲得外源基因高水平表達。轉基因肌肉發(fā)生血管增生、血流增強的生物學效應。結論 構建了人bFGF真核表達質粒，并可在體內外順利表達，為進一步組織移植或組織工程基因治療研究奠定了基礎。
目的克隆大鼠galectin-9基因全長cDNA，構建含大鼠galectin-9基因的重組腺病毒載體，并予以鑒定。方法從大鼠的肝臟組織中用RT-PCR的方法克隆擴增大鼠galectin-9基因，再定向插入到帶NotⅠ和HindⅢ酶切的pDC316-GFP穿梭質粒中，獲得穿梭質粒pDC316-GFP-galectin-9。經PCR、NotⅠ和HindⅢ酶切及測序鑒定后，用脂質體將穿梭質粒pDC316-GFP-galectin-9與腺病毒骨架質粒pBHGlox△E1.3Cre共轉染HEK-293細胞。經位點特異性重組獲得含目的基因的重組腺病毒Ad5-galectin-9，行PCR鑒定，經HEK-293細胞擴增及純化制備高滴度病毒液，用細胞培養(yǎng)方法測定病毒TCID50滴度。結果 PCR、酶切及測序證實穿梭質粒構建正確，PCR鑒定證實大鼠galectin-9基因重組腺病毒載體構建正確，病毒的感染滴度為1.4×109 U/ml。結論成功構建了含大鼠galectin-9基因的重組腺病毒表達載體，為進一步研究大鼠galectin-9基因的功能奠定了基礎。
目的構建人CD59真核表達載體pSecTag2/HygroB-CD59，并利用殼聚糖（chitosan）組裝成納米微粒復合體，轉染小鼠NIH3T3細胞。方法應用PCR方法，從CD59-pGEM-T Easy Vector克隆相關的DNA序列，插入到具有相應酶切位點的真核表達載體pSecTag2/HygroB中，構建pSecTag2/HygroB-CD59真核表達質粒，并進行酶切鑒定及序列測定。利用殼聚糖包裹質粒，轉染小鼠NIH3T3細胞，并用抗CD59抗體對轉染細胞進行免疫組織化學染色。結果CD59基因大小為312 bp，與Genbank中記載的人CD59 cDNA序列結果完全一致。利用殼聚糖-CD59納米微粒轉染NIH3T3細胞24 h后，免疫組織化學染色顯示轉染細胞CD59呈彌漫性胞漿陽性。結論成功構建了人CD59真核表達載體并通過殼聚糖介導轉染NIH3T3細胞，為進一步探討及研究轉基因肝臟奠定了基礎。