目的 檢測高遷移率族蛋白B1( HMGB1) 和α平滑肌肌動蛋白( α-SMA) 在博萊霉素( BLM) 致小鼠肺纖維化模型肺內的表達水平, 探討HMGB1 在肺纖維化發(fā)病機制中的作用。方法 取20 只4 ～6 周齡C57BL/6 雄性小鼠, 隨機分為BLM組和生理鹽水( NS) 對照組, 每組10 只。分別向氣管內灌注BLM( 3 mg /kg) 和NS, 10 d 后處死小鼠。應用RT-PCR 法檢測兩組肺組織HMGB1 和α-SMA的mRNA 表達水平, 應用免疫組織化學檢測兩組肺組織中HMGB1 和α-SMA的蛋白表達水平。結果 RT-PCR 半定量和免疫組織化學半定量分析結果顯示, BLM組HMGB1 的mRNA 和蛋白表達均較NS 對照組顯著增加( 0. 61 ±0. 08 比0. 15 ±0. 02, 13. 12 ±1. 33 比7. 92 ±1. 10, P 均lt;0. 01) ; BLM組α-SMA 的mRNA 和蛋白表達均較NS 對照組顯著增加( 0. 89 ±0. 12 比0. 60 ±0. 07,13. 66 ±1. 01 比8. 18 ±1. 33, P 均lt;0. 01) 。結論 在BLM誘導的肺纖維化中肺組織的HMGB1 和α-SMA 表達增加。肺纖維化病理過程可能與HMGB1 表達增加并活化α-SMA 的表達有關
目的 探討IL-10 對小鼠巨噬細胞髓樣分化因子88( MyD88) / 核因子κB( NF-κB) 炎癥信號活化的影響。方法 將小鼠巨噬細胞Ana-1 分為脂多糖( LPS) 組和LPS + IL-10 組, 分別于0. 5、1及2 h 收集巨噬細胞和細胞培養(yǎng)上清液,Western blot 檢測細胞MyD88 與胞漿、胞核NF-κB p65 亞基表達, ELISA 法檢測培養(yǎng)上清中腫瘤壞死因子α( TNF-α) 含量。結果 在0 ～2 h, LPS 組細胞MyD88表達顯著持續(xù)上升, LPS +IL-10 組于LPS刺激后上升, 0. 5 h 達峰值, 2 h 恢復至正常水平, 1 h 和2 h相對含量均低于LPS 組( 11. 6 ±1. 3 比17. 5 ±0. 7, 8. 8 ±0. 3 比21. 4 ±1. 8, P lt; 0. 05) ; 總NF-κB 表達量在兩組間無明顯差異。NF-κB 核漿比變化趨勢與MyD88 類似, LPS + IL-10 組1 h 及2 h 相對含量亦均低于LPS 組( 1. 1 ±0. 1 比2. 4 ±0. 4,0. 6 ±0. 7 比3. 1 ±0. 6, P lt;0. 05) ; 相應的, LPS+ IL-10 組1 h和2 h TNF-α含量亦低于LPS 組[ ( 222. 5 ±33. 5) pg/mL 比( 365. 2 ±22. 7 ) pg/mL, ( 212. 7 ±15. 9) pg/mL比( 566. 2 ±31. 5) pg/mL, P lt;0. 05] 。結論 IL-10 通過抑制減少MyD88/NF-κB 信號通路活化, 降低TNF-α表達, 從而下調炎癥反應強度。
目的 比較乳酸乳球菌及植物乳桿菌對塵螨致變應性氣道炎癥小鼠的免疫調節(jié)作用,對其脾細胞MAPK 通路的影響及可能機制。方法 將實驗小鼠分對照組( N組) 、塵螨組( 單純塵螨致敏激發(fā), M組) 、塵螨+ 乳酸乳球菌組及塵螨+ 植物乳桿菌組[ 塵螨致敏激發(fā)同時分別用乳酸乳球菌灌胃( L組) , 植物乳桿菌灌胃( P 組) ] , 末次激發(fā)后3 d 行肺組織病理學檢查, ELISA 法檢測脾細胞培養(yǎng)上清IL-10 水平, 流式細胞術檢測CD3 + CD4 + 脾細胞分泌IL-4 / IFNγ水平,Western blot 法檢測脾細胞中總的及磷酸化P38、ERK 和JNK 蛋白水平。結果 口服乳酸菌明顯減輕塵螨致敏激發(fā)導致的嗜酸細胞性氣道炎癥, 以喂服乳酸乳球菌更顯著。L 組及M組脾細胞培養(yǎng)上清IL-10 的生成顯著增加( P lt;0. 05) , 并以L組更明顯, 且其IL-10 的釋放率亦明顯高于其余三組( P lt;0. 05) ; 流式細胞術顯示L組和P組分泌IL-4 的CD4 + 細胞減少的同時, 總CD4 + 細胞比例反而增高, 以L 組為明顯。M組與P組磷酸化P38 表達水平較N組顯著增高, L 組與N組比較基本無變化, 各組間的磷酸化ERK 及JNK 無明顯差異。結論 口服乳酸乳球菌可改善塵螨所致小鼠嗜酸粒細胞性氣道炎癥, 其免疫調節(jié)可能與誘導CD4 + 調節(jié)T細胞, 分泌抑制性細胞因子IL-10, 下調P38 MAPK 通路活性, 從而下調Th2炎癥相關。
目的 觀察活性氧清除劑N-乙酰半胱氨酸( NAC) 對博萊霉素誘導的肺纖維化小鼠的影響, 探討NAC 抑制肺纖維化的可能機制。方法 將45 只SPF 級雌性昆明小鼠隨機分為3 組: 對照組( 氣管內霧化生理鹽水) 、纖維化組( 氣管內博萊霉素3 mg/kg 溶于100 μL 生理鹽水內霧化) 、NAC處理組( 氣管內霧化博萊霉素后, NAC 400 mg·kg- 1·d- 1溶于100 μL 生理鹽水內灌胃) 。處理后第28 d 收集樣本。小鼠左肺置于10% 中性甲醛固定, 石蠟包埋切片后行HE 與Masson 染色; 右肺堿水解法檢測肺組織羥脯氨酸的含量; 比色法檢測血清丙二醛( MDA) 的濃度和總抗氧化能力( T-AOC) ;提取肺組織總蛋白和總RNA, 分別采用Western blot 和RT-PCR 法檢測NADPH 氧化酶1( NOX1) 、NOX2 及NOX4 的基因和蛋白表達水平。結果 NAC 處理組小鼠肺組織病理損傷較纖維化組減輕,氣道上皮下膠原沉積及肺組織羥脯氨酸含量明顯減少( P lt;0. 05) , 血清MDA 濃度較纖維化組顯著降低( P gt;0. 05) , 血清T-AOC 較纖維化組升高( P =0. 029) 。纖維化組NOX1/2/4 基因及蛋白表達較對照組顯著增強( P lt;0. 05) , NAC 干預后NOX1/2 /4 基因及蛋白表達水平均有所下調, NOX4 蛋白表達明顯低于纖維化組( P =0. 001) 。與對照組比較差異無統(tǒng)計學意義( P gt;0. 05) 。結論 NAC 能顯著改善博萊霉素誘導的小鼠肺纖維化, 其機制與抑制NOX4 蛋白表達、下調氧化應激損傷有關。
目的 探討急性肺損傷炎癥狀態(tài)下谷胱甘肽硫轉移酶M5(GSTM5)對人支氣管上皮細胞16HBE炎癥水平的影響及其可能的分子機制。 方法 腫瘤壞死因子α(TNF-α；10 ng/mL)誘導16HBE，建立急性肺損傷細胞炎癥模型，分組處理如下：空白對照組、TNF-α組(TNF-α)、GSTM5組(GSTM5+TNF-α)、陰性對照組(陰性對照質粒+TNF-α)。GSTM5組及陰性對照組分別采用脂質體Lipofectamine2000轉染導入GSTM5-GFP質粒及陰性對照質粒；酶聯(lián)免疫吸附試驗檢測各組細胞上清液中IL-6、IL-8、IL-10的含量，反轉錄聚合酶鏈反應檢測NF-κB mRNA表達水平，蛋白質印跡法檢測NF-κB、P-NF-κB、p38、P-p38蛋白表達水平。 結果 熒光顯微鏡檢查證實成功構建GSTM5-GFP真核表達質粒并轉染成功。TNF-α誘導后，細胞培養(yǎng)上清液中IL-6、IL-8、IL-10濃度較空白對照組升高(P＜0.05)，GSTM5組細胞上清液中IL-6、IL-8、IL-10均較TNF-α組降低(P＜0.05)，差異有統(tǒng)計學意義；同時，TNF-α刺激后各組細胞總NF-κB mRNA轉錄水平、NF-κB、p38磷酸化水平均較空白對照組增高(P＜0.05)，而GSTM5組較TNF-α組與陰性對照組降低(P＜0.05)。 結論 過表達GSTM5可下調TNF-α誘導的人支氣管上皮細胞16HBE炎癥水平，其機制與GSTM5抑制p38MAPK、NF-κB磷酸化密切相關。
目的 研究轉染叉頭蛋白O1(FOXO1)后A549細胞基因表達譜的改變,為深入探討FOXO1在急性肺損傷中的作用機制提供線索。 方法 應用腫瘤壞死因子α(TNF-α)刺激A549細胞,應用脂質體介導的轉染方法將真核表達載體GV230-FOXO1轉染入經TNF-α誘導的A549細胞,再提取細胞的總RNA,應用基因芯片技術進行分析。 結果 成功構建并驗證了FOXO1真核表達載體,提取了高質量的mRNA進行芯片分析,并通過RNA質量控制(RNA QC)驗證。芯片分析結果顯示差異表達基因中上調的基因有317個,下調的基因有237個。這些差異表達的基因功能涉及細胞增殖、凋亡、分化等多個方面。 結論 應用基因芯片技術可成功篩選轉染FOXO1基因后A549細胞的差異表達基因。FOXO1在急性肺損傷中可能通過改變細胞的增殖、凋亡與分化等水平來影響疾病的進程。
目的以表皮生長因子受體酪氨酸激酶抑制劑（EGFR-TKI）吉非替尼對博來霉素所致小鼠肺纖維化進行干預，探討轉錄因子叉頭盒 O3a（Foxo3a）的相關下游信號通路，闡明 Foxo3a 在肺纖維化中可能的作用機制。方法將 30 只 6 周齡 SPF 級 C57BL/6 小鼠（雌雄各半）隨機平均分為 3 組：對照組（氣管內滴入 0.9% 的氯化鈉注射液）、博來霉素組（氣管內滴入博來霉素 3 mg/kg）和吉非替尼組（氣管內滴入博來霉素 3 mg/kg 后以吉非替尼 20 mg·kg–1·d–1灌胃）。14 d 后收集小鼠肺組織，左肺行 HE 及 Masson 染色，取右肺以逆轉錄–聚合酶鏈反應法與免疫印跡法分別檢測 α-平滑肌肌動蛋白（α-SMA）、上皮鈣黏素（E-cadherin）、高遷移率族蛋白 B1（HMGB1）、Foxo3a、叉頭盒 M1（FoxM1）、Snail1 mRNA 與蛋白表達水平。結果吉非替尼處理后，肺組織病理損傷及纖維化程度評分較博來霉素組明顯降低（均 P<0.01），與博來霉素組比較，α-SMA、Snail1（均 P<0.01）、HMGB1（P<0.05）mRNA 表達水平下調，E-cadherin（P<0.01）、Foxo3a、FoxM1（均 P>0.05）mRNA 表達水平上調；α-SMA（P<0.05）、Snail1（P<0.01）、HMGB1 蛋白水平（P<0.05）以及 Foxo3a 蛋白磷酸化水平（P<0.01）表達下調，E-cadherin（P<0.05）、Foxo3a 及 FoxM1 蛋白表達上調（均 P>0.05）。結論Foxo3a 活性增加可下調 Snail1，使 α-SMA 表達降低、E-cadherin 表達升高，從而減輕博來霉素誘導的小鼠肺纖維化。
目的 比較兩種表皮生長因子受體酪氨酸激酶抑制劑( EGFR-TKI) 吉非替尼與厄羅替尼對博萊霉素致小鼠肺纖維化的干預作用。方法 40 只雌性BALB/ c 小鼠分為對照組( NS 組) 、博萊霉素纖維化組( BLM組) 、吉非替尼組( GE 組) 和厄羅替尼組( ER 組) 。實驗第1 d, BLM組、GE 組和ER 組小鼠經氣管滴入博萊霉素致肺纖維化, NS 組氣管內滴入生理鹽水; 同時, GE 組及ER 組分別口服吉非替尼( 20 mg·kg- 1·d - 1 ) 和厄羅替尼( 25 mg·kg- 1· d- 1 ) , 余兩組口服生理鹽水。持續(xù)給藥2 周后殺鼠取肺, 左肺石蠟包埋切片行HE 染色與Masson 染色, 免疫組化檢測總EGFR 及磷酸化EGFR; 右肺勻漿檢測羥脯氨酸含量。結果 吉非替尼與厄羅替尼均能明顯減輕博萊霉素引起的肺結構破壞、膠原沉積, 降低磷酸化EGFR 表達及纖維化小鼠肺羥脯氨酸含量( P lt;0. 05) , 兩者的上述作用無明顯差異( P gt;0. 05) 。結論 EGFR-TKI 通過抑制EGFR 磷酸化, 有效減輕博萊霉素誘導的肺纖維化形成, 為肺纖維化的靶向治療提供了新思路。
目的 建立急性肺損傷肺泡上皮細胞炎癥模型, 探討NF-κB p65 基因在炎癥誘導的氧化應激損傷中的作用。方法 以腫瘤壞死因子α( TNF-α, 10 ng/mL) 刺激A549 細胞, 運用RNA 干擾技術沉默核因子κB( NF-κB) p65 基因, 采用RT-PCR 及Western blot 法檢測沉默效率, ELISA 法檢測細胞培養(yǎng)上清中白細胞介素1β( IL-1β) 、IL-4、IL-6 等炎癥因子濃度, 比色法檢測細胞內丙二醛( MDA) 及超氧化物歧化酶( SOD) 濃度, MTT 法檢測細胞存活率。結果 TNF-α刺激A549 細胞可在基因及蛋白水平上調NF-κB p65 的表達, 并增加NF-κB 蛋白的核轉位; 同時細胞培養(yǎng)上清中IL-1β、IL-4、IL-6 的濃度升高, 細胞內MDA 增多, SOD 減少, 細胞存活率降低。預轉染NF-κB p65 siRNA 可在基因水平及蛋白水平有效沉默NF-κB p65 表達, 降低TNF-α誘導的上述各炎癥因子及MDA 濃度的增高, 減少SOD 的耗損, A549 細胞存活率升高( Plt;0.05) 。結論 NF-κB 能介導TNF-α觸發(fā)的過度炎癥反應和氧化應激, 導致細胞存活率明顯降低; 沉默NF-κB p65 基因可有效下調炎癥反應水平及其誘發(fā)的氧化應激, 減輕肺結構細胞的損傷。
目的 比較脂多糖( LPS) 經三種不同給藥方式復制急性肺損傷( ALI) 小鼠模型的病理損傷特征及炎癥反應程度, 優(yōu)化ALI 小鼠造模方法。方法 BLAB/ c 小鼠麻醉后分別采用氣管內霧化( ITA 組) 、氣管內滴入( ITI 組) 和腹腔注射( IPI 組) LPS( 5 mg/kg) 的方法復制ALI 小鼠模型, 同時用伊文斯藍取代LPS 顯示氣管內霧化和滴入時藥物的肺內分布。LPS 給藥2 h 后處死小鼠, 分別取肺組織行干濕重比、HE 染色及病理評分,Western blot 檢測肺組織IκB-α含量及IκB-α、NF-κB p65 磷酸化水平, qRT-PCR 檢測肺組織TNF-α和IL-1βmRNA 轉錄強度。結果 ITA 組伊文斯藍在小鼠各肺葉中分布較ITI 組更均勻。LPS 給藥2 h 后ITA 組、ITI 組和IPI 組小鼠肺組織干濕重比和病理損傷評分均顯著高于正常對照組( NC 組, P lt; 0. 01) , 其中ITA 組病理損傷評分最重( P lt;0. 05) 。Western blot 結果顯示ITA 組小鼠肺組織IκB-α降解程度、IκB-α和NF-κB p65 磷酸化水平均顯著高于ITI 組 ( P lt;0. 05) , 而ITI 組又顯著高于IPI 組( P lt;0. 05) 。qRT-PCR 結果顯示ITA 組小鼠肺組織TNF-α和 IL-1βmRNA 轉錄強度均顯著高于ITI 組( P lt; 0. 05) , 而ITI 組又顯著高于IPI 組( P lt; 0. 05) 。結論 氣管內霧化LPS 造成的肺組織病理損傷和炎癥反應更加廣泛和嚴重, 且具有手術創(chuàng)傷小、操作方便等特點, 是復制急性肺損傷小鼠模型的優(yōu)選方案