【摘 要】 目的 探討人羊水來源c-kit+ 間充質(zhì)干細(xì)胞（c-kit+ human amniotic fluid-derived mesenchymal stemcells，c-kit+ HAFMSCs）的生物學(xué)特征及心肌誘導(dǎo)分化能力。 方法 通過產(chǎn)前診斷或自愿引產(chǎn)獲取50 份孕中期羊水標(biāo)本，經(jīng)流式細(xì)胞儀分選c-kit+ HAFMSCs，MTT 法觀察細(xì)胞增殖情況，并通過流式細(xì)胞儀、細(xì)胞免疫化學(xué)染色觀察行細(xì)胞表型鑒定。在體外經(jīng)成骨及成脂誘導(dǎo)分化，于誘導(dǎo)培養(yǎng)后21 d 采用von Kossa 染色觀察鈣沉積顆粒，油紅O 染色觀察脂滴形成情況。實(shí)時(shí)熒光定量PCR 檢測(cè)細(xì)胞經(jīng)5 氮-2’ 脫氧胞苷心肌誘導(dǎo)前后，NKx2.5、Tbx5、GATA-4、α-MHC 4 種心肌特異性基因表達(dá)情況。 結(jié)果 經(jīng)流式細(xì)胞儀分選，人孕中期羊水中c-kit+ HAFMSCs 含量約為貼壁細(xì)胞的3.07% ± 1.03%；體外增殖迅速，表達(dá)MSCs 表面標(biāo)志CD29、CD44、CD73、CD90、CD105，不表達(dá)造血干細(xì)胞表面標(biāo)志CD34、CD45；表達(dá)人類白細(xì)胞抗原（human leukocyte antigen，HLA）-ABC，不表達(dá)HLA-DR。細(xì)胞免疫化學(xué)染色示CD29、CD44、CD73、CD90、CD105、Oct-4 染色呈陽性，CD34、CD45 染色呈陰性。MTT 檢測(cè)示第5、10、15 代c-kit+ HAFMSCs 具有相似的生長曲線。成骨和成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)后21 d，細(xì)胞內(nèi)有鈣鹽沉積和脂滴形成。實(shí)時(shí)熒光定量PCR 檢測(cè)示，心肌誘導(dǎo)后14 d， NKx2.5、Tbx5、GATA-4、α-MHC 4 種心肌特異性基因表達(dá)均較誘導(dǎo)前明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P lt; 0.05）。 結(jié)論 通過流式細(xì)胞儀分選的c-kit+ HAFMSCs 在體外可以誘導(dǎo)分化為心肌樣細(xì)胞，可能成為心肌再生性治療的種子細(xì)胞。
【摘 要】 目的 體外分離培養(yǎng)人羊水間充質(zhì)干細(xì)胞（human amniotic fluid-derived mesenchymal stem cells，HAFMSCs），觀察低溫凍存復(fù)蘇后HAFMSCs 生物學(xué)特征，為進(jìn)一步研究奠定理論基礎(chǔ)。 方法 取12 份自愿捐贈(zèng)的孕16 ～ 20 周羊水標(biāo)本，采用改良兩步法分離培養(yǎng)HAFMSCs，用含量不同的FBS、DMSO 凍存液凍存細(xì)胞，液氮凍存12 周后42℃水浴復(fù)蘇，錐蟲藍(lán)染色檢測(cè)細(xì)胞存活率，MTT 法檢測(cè)細(xì)胞增殖速度并繪制生長曲線，流式細(xì)胞儀檢測(cè)凍存復(fù)蘇后HAFMSCs 表型。對(duì)凍存復(fù)蘇后的HAFMSCs 進(jìn)行成脂、成骨誘導(dǎo)分化培養(yǎng)，并分別采用油紅O、von Kossa 染色進(jìn)行鑒定；實(shí)時(shí)熒光定量PCR 分析細(xì)胞凍存前后Oct-4、Nanog mRNA 表達(dá)差異。 結(jié)果 細(xì)胞凍存12 周后，不同的凍存方案對(duì)細(xì)胞存活率影響有差異，優(yōu)化的凍存方案為DMEM/FBS/DMSO=50%/40%/10%。凍存復(fù)蘇后的HAFMSCs 呈漩渦狀排列，生長曲線呈S 形，與凍存前細(xì)胞生長曲線相似。流式細(xì)胞儀檢測(cè)示凍存復(fù)蘇后細(xì)胞的MSCs 表型CD29、CD44、CD73、CD90 為陽性，造血干細(xì)胞表型CD34、CD45 為陰性。成脂、成骨誘導(dǎo)21 d，油紅O、von Kossa 染色均呈陽性。實(shí)時(shí)熒光定量PCR 檢測(cè)示凍存前后Oct-4、Nanog mRNA 表達(dá)水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P gt; 0.05）。 結(jié)論 HAFMSCs 具有體外增殖快、分化能力強(qiáng)的優(yōu)勢(shì)；并可耐受短期凍存，復(fù)蘇后細(xì)胞存活率高，生物學(xué)特征及分化潛能未發(fā)生明顯變化，凍存液DMEM/FBS/DMSO=50%/40%/10% 是較好凍存方案。