建立人結(jié)腸癌細胞株SW480裸鼠移植瘤模型，觀察8肽生長抑素(SMS 201-995，SMS)對移植瘤的作用及機理。結(jié)果∶SMS組及SMS+PG(5肽胃泌素)組移植瘤的體積、重量、瘤細胞內(nèi)cAMP、DNA、蛋白質(zhì)含量、S期和G2M期細胞數(shù)及增殖指數(shù)均顯著低于PG組及對照組，PG組顯著高于對照組；而G0/G1期細胞數(shù)則顯著高于PG組及對照組，PG組顯著低于對照組。本實驗結(jié)果提示：生長抑素具有直接抑制人結(jié)腸癌細胞株SW480移植瘤生長的作用，又可抑制胃泌素對移植瘤的促增殖作用。這種作用機理是通過抑制瘤細胞內(nèi)cAMP、DNA和蛋白質(zhì)的合成，從而抑制瘤細胞從G0/G1期進入到S期和G2M期。這為大腸癌患者應用生長抑素類似物進行內(nèi)分泌治療提供了實驗依據(jù)。
目的探討連續(xù)多次注射富血小板血漿（platelet-rich plasma，PRP）對脂肪移植成活率及移植質(zhì)量的影響，為臨床應用提供實驗依據(jù)。 方法取接受吸脂手術的1名25歲健康女性自愿捐贈的大腿后外側(cè)區(qū)脂肪，采用靜置法純化脂肪顆粒；抽取其外周靜脈血，經(jīng)兩次200 × g離心10 min收集PRP；將PRP與10%CaCl2溶液以10∶1混合。選取5周齡雌性裸鼠24只，體重（20 ± 3）g，隨機分為實驗組與對照組（n=12）。實驗組于裸鼠左、右側(cè)背部皮下各注射脂肪顆粒與PRP（10∶2）混合物0.8 mL，對照組注射相同劑量脂肪顆粒與生理鹽水（10∶2）混合物。在首次移植后5、10 d，兩組再次分別注射PRP與生理鹽水0.14 mL。移植后觀察裸鼠存活情況；于首次移植后15、30、90、180 d，兩組取標本進行大體觀察，測定組織塊重量與體積；組織學觀察組織與細胞形態(tài)特征，計算壞死面積比與微血管計數(shù)。結(jié)果裸鼠均成活至實驗完成，兩組移植部位均未出現(xiàn)感染及破潰。各時間點實驗組組織塊表面血管生成以及橫切面液化、壞死情況均好于對照組。首次移植后15、30、90 d實驗組組織塊重量及體積均顯著大于對照組（P lt; 0.05），180 d時兩組組織塊重量及體積相似（P gt; 0.05）。組織學觀察示實驗組各時間點脂肪細胞形態(tài)結(jié)構(gòu)均清晰，中心區(qū)空泡逐漸增大，無明顯壞死物質(zhì)及鈣化發(fā)生；對照組脂肪細胞形態(tài)結(jié)構(gòu)逐漸紊亂，且出現(xiàn)大量壞死物質(zhì)，鈣化明顯。實驗組15、180 d時壞死面積比均小于對照組，微血管計數(shù)均多于對照組，差異均有統(tǒng)計學意義（P lt; 0.05）。 結(jié)論180 d內(nèi)連續(xù)多次注射PRP輔助脂肪移植能促進脂肪成活并提高移植質(zhì)量。
目的探討血管基質(zhì)片段（vascular stromal fraction，SVF）輔助游離脂肪移植促進其早期存活的相關機制。 方法取5例行腹部抽脂手術女性患者自愿捐贈的脂肪組織分離、培養(yǎng)SVF。4～6周齡裸鼠24只（體重15～18 g），將裸鼠背部左、右側(cè)隨機分為A、B組（n=24），采用Coleman技術分別于A、B組裸鼠背部皮下移植脂肪0.5 mL和含5 × 105個SVF的脂肪0.5 mL。移植后1、3、5、7 d分別取6只裸鼠，取出移植脂肪組織，行大體觀察、CD31免疫組織化學染色及Western blot檢測分析。 結(jié)果隨著移植時間增加，A、B組移植脂肪組織濕重均呈上升趨勢，但各時間點A、B組間比較差異均無統(tǒng)計學意義（P gt; 0.05）。移植后1、3 d兩組均未見CD31陽性細胞；5、7 d B組CD31陽性細胞數(shù)顯著高于A組（P lt; 0.05），兩組7 d時CD31陽性細胞數(shù)顯著高于5 d時（P lt; 0.05）。Western blot檢測示，兩組移植脂肪中VEGF蛋白表達在移植后第3天達峰值，隨后開始下降；1、3、5 d B組VEGF蛋白表達明顯高于A組（P lt; 0.05）。兩組移植脂肪中HGF蛋白表達在移植后前5 d均保持在較高水平，7 d開始下降，B組均明顯高于A組（P lt; 0.05）。 結(jié)論在游離脂肪移植早期，SVF通過旁分泌生長因子促進移植脂肪血管生成。
目的探討與聚乳酸聚乙酸共聚物[poly（lactide-co-glycolide），PLGA]支架復合后的成肌細胞體外經(jīng)軟骨來源形成蛋白2（cartilage-derived morphogenetic protein 2，CDMP-2）聯(lián)合TGF-β1誘導后，能否在裸鼠體內(nèi)異位構(gòu)建組織工程軟骨。 方法取1歲齡雄性比格犬股直肌肌肉分離培養(yǎng)成肌細胞，取第4代成肌細胞接種于PLGA支架，加入含CDMP-2與TGF-β1的軟骨誘導液體外培養(yǎng)2周。實驗分為4組：A組為經(jīng)軟骨誘導的成肌細胞-PLGA復合物組，B組為未經(jīng)軟骨誘導的成肌細胞-PLGA復合物組，C組為經(jīng)軟骨誘導的單純PLGA支架組，D組為單純PLGA支架組。于24只裸鼠背部皮下兩側(cè)制備4個皮下腔隙，分別植入4組材料。術后8、12周處死裸鼠，取材行大體觀察、HE及甲苯胺藍染色、Ⅰ型膠原及Ⅱ型膠原免疫組織化學染色觀察，RT-PCR檢測Ⅰ型膠原、Ⅱ型膠原、蛋白聚糖（Aggrecan）、Sox9 mRNA表達，阿利新藍染色檢測糖胺聚糖（glycosaminoglycans，GAG）含量，生物力學試驗檢測標本壓縮彈性模量。 結(jié)果A組標本術后8周呈類軟骨樣，乳白色，表面光潔，有彈性；12周時外觀和彈性與正常軟骨相似。B組術后8周僅殘余少許組織，12周已完全降解；C、D組標本術后8周均降解消失。HE染色示A組8、12周時有成熟軟骨陷窩形成；B組8周時組織內(nèi)未見軟骨陷窩形成。甲苯胺藍染色示A組8、12周時組織內(nèi)新生軟骨細胞形成，細胞橢圓，排列整齊，細胞陷窩形成，細胞質(zhì)和細胞外基質(zhì)均藍染陽性；B組8周時組織內(nèi)未見藍染的細胞外基質(zhì)。Ⅰ、Ⅱ型膠原免疫組織化學染色示A組8、12周時均呈陽性表達；B組8周時呈陰性表達。RT-PCR檢測示術后8、12周A組均可見Ⅰ型膠原、Ⅱ型膠原、Aggrecan和Sox9 mRNA表達，B組均呈陰性。術后12周A組壓縮彈性模量為（90.79 ± 1.78） MPa，GAG含量為（10.20 ± 1.07）μg/mL與正常半月板相比，差異有統(tǒng)計學意義（P lt; 0.05）。 結(jié)論體外CDMP-2聯(lián)合TGF-β1軟骨誘導的比格犬成肌細胞復合PLGA支架后具備在裸鼠體內(nèi)異位構(gòu)建組織工程軟骨的能力。
【摘 要】 目的 探討毛乳頭細胞對表皮干細胞與同種異體脫細胞真皮基質(zhì)構(gòu)建的組織工程皮膚血管化的影響。 方法 取門診包皮環(huán)切術患者皮膚，用于表皮細胞培養(yǎng)；取孕19、20 周引產(chǎn)胎兒頭部皮膚，用于毛乳頭細胞培養(yǎng)；患者及家屬均知情同意。以中性蛋白酶聯(lián)合胰蛋白酶消化、分離表皮細胞，Ⅳ型膠原黏附法分選表皮干細胞；以Ⅰ型膠原酶消化法分離毛乳頭，常規(guī)成纖維細胞培養(yǎng)液培養(yǎng)。以同種異體脫細胞真皮基質(zhì)為支架，在真皮基質(zhì)的真皮乳頭側(cè)種植毛乳頭細胞，基底膜側(cè)種植表皮干細胞構(gòu)建實驗組組織工程皮膚替代物；對照組組織工程皮膚替代物不種植毛乳頭細胞。取6 ～ 8 周齡BALB/C-nu 裸鼠60 只，隨機分成實驗組和對照組（n=30）；實驗動物背部制造1 cm × 1 cm 大小全層皮膚缺損模型，將兩組組織工程皮膚替代物移植修復創(chuàng)面，2 周后觀察移植皮膚成活率。術后2、4 周，取移植皮膚替代物標本，行HE 及免疫組織化學染色，觀察移植皮膚替代物CD31 表達水平，并計算兩組標本血管密度。 結(jié)果 Ⅳ型膠原分選后表皮細胞同時表達角蛋白19、β1 整合素，提示為表皮干細胞。由毛乳頭培養(yǎng)出的細胞表達α 平滑肌肌動蛋白，提示為毛乳頭細胞。動物移植術后2 周，實驗組移植皮膚成活率為93.3%（28/30），對照組為80.0%（24/30），比較差異有統(tǒng)計學意義（χ2=2.31，P=0.00）。HE 染色觀察示實驗組表皮層達12 層，表皮細胞體積較大；對照組表皮層達4 ～ 6 層，表皮細胞體積較小。實驗組術后2、4 周，血管密度分別為（38.56 ± 2.49）個/mm2 和（49.12 ± 2.39）個/mm2，對照組分別為（25.16 ± 3.73） 個 / mm2 和（36.26 ± 3.24） 個 / mm2，兩組比較差異均有統(tǒng)計學意義（P lt; 0.01）。 結(jié)論 毛乳頭細胞可促進移植皮膚替代物血管形成，利于表皮層重建，提高組織工程皮膚移植成活率。
目的 人Ⅰ型前膠原基因（Col Ⅰ A1）反義寡核苷酸（antisense oligodeoxyneucleotide，ASODN）對體外培養(yǎng)的人增生性瘢痕成纖維細胞有抑制膠原合成作用，擬進一步探討Col Ⅰ A1 ASODN 對裸鼠移植模型體內(nèi)的人增生性瘢痕的膠原合成作用。 方法 SPF 級BALB/c-nunu 品系6 ～ 8 周齡雌性裸鼠60 只，體重約20 g；取行瘢痕切除手術患者自愿捐贈的瘢痕組織塊去表皮后，移植至裸鼠背部肩胛內(nèi)側(cè)皮下，每只裸鼠移植1 塊，制備人增生性瘢痕裸鼠移植模型。將58 只成功制備模型的裸鼠根據(jù)處理方法不同，隨機分成3 組，于瘢痕移植2 周根據(jù)分組行經(jīng)皮穿刺瘢痕內(nèi)注射。A 組（n=20）：5 μL 濃度為3 mmol/L Col Ⅰ A1 ASODN、3 μL 脂質(zhì)體、92 μL Opti-MEM Ⅰ減血清培養(yǎng)基；B 組（n=20）： 3 μL 脂 質(zhì)體、97 μL Opti-MEM Ⅰ減血清培養(yǎng)基；C 組（n=18）：100 μL Opti-MEM Ⅰ減血清培養(yǎng)基。實驗最初2 周每天注射1 次，之后隔天1 次，至實驗取材。注射后2、4、6 周，對存活裸鼠進行瘢痕硬度測量后，處死裸鼠取瘢痕組織行膠原染色組織學觀察以及透射電鏡觀察；提取細胞總RNA 后行RT-PCR 測定Col Ⅰ A1 mRNA 相對含量；ELISA 法行Col Ⅰ A1 蛋白定量分析。 結(jié)果 注射后6 周內(nèi)17 只裸鼠死亡；共41 只裸鼠40 塊瘢痕組織符合實驗標準，納入實驗；A、B、C 組各14、13、14 只。注射后2 周，3 組間瘢痕硬度比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P gt; 0.05）；4、6 周時A 組與B、C 組比較， 差異有統(tǒng)計學意義（P lt; 0.05），B、C 組間比較差異無統(tǒng)計學意義（P gt; 0.05）。隨時間延長，組織學觀察示3 組Ⅲ型膠原表達上升，A 組最明顯，Ⅰ型膠原排列規(guī)則。透射電鏡觀察示A 組成纖維細胞退化，膠原纖維排列更趨于一致；B、C 組膠原纖維排列也逐漸規(guī)則。注射后2、4 周3 組間Col Ⅰ A1 mRNA 和蛋白表達量比較，差異均有統(tǒng)計學意義（P lt; 0.05）；6 周時A 組與B、C 組比較，差異有統(tǒng)計學意義（P lt; 0.05），B、C 組間比較差異無統(tǒng)計學意義（P gt; 0.05）。 結(jié)論 在人增生性瘢痕裸鼠移植模型的瘢痕內(nèi)注射Col Ⅰ A1 ASODN 可抑制Col Ⅰ A1 mRNA 及Ⅰ型膠原表達，促進瘢痕組織成熟、軟化，脂質(zhì)體可促進該抑制效果。
目的 目前組織工程骨（tissue engineered bone，TEB）缺乏有效可行的儲存、運輸方法。評估TEB 經(jīng)過凍干處理后其成骨活性變化及其異位成骨能力，探索新的TEB 儲存和運輸策略。 方法 取志愿者捐獻的骨髓和骨組織分別培養(yǎng)hBMSCs 和制備脫鈣骨基質(zhì)（decalcified bone matrix，DBM），取第3 代hBMSCs 與DBM 復合構(gòu)建TEB，分別于體外孵育3、5、7、9、12、15 d 經(jīng)過低溫干燥后得到凍干組織工程骨（freeze-dried tissue engineered bone，F(xiàn)TEB），并將體外培養(yǎng)不同時間點的TEB 和FTEB 行掃描電鏡觀察。Western blot 法檢測TEB 和FTEB 內(nèi)成骨相關蛋白BMP-2、TGF-β1、IGF-1 的變化。將FTEB、TEB 和DBM 分別移植于30 只6 周齡BALB/C 裸鼠皮下進行異位成骨實驗（n=10），并行X 線片評分、CT 值檢測以及HE 染色觀察。 結(jié)果 掃描電鏡觀察示，TEB 中種子細胞保持正常形態(tài)，隨著培養(yǎng)時間的延長分泌細胞外基質(zhì)逐漸增加；FTEB 內(nèi)的種子細胞脫水皺縮而亡，細胞外基質(zhì)位于疏松的DBM 支架材料中。Westernblot 檢測示，TEB 和FTEB 內(nèi)BMP-2、TGF-β1 和IGF-1 表達均為陽性，除體外培養(yǎng)15 d TEB 和FTEB 的TGF-β1 蛋白積分吸光度（IA）比值比較差異有統(tǒng)計學意義（P lt; 0.05）外，其余各時間點各蛋白含量比較差異均無統(tǒng)計學意義（P gt; 0.05）。移植術后4 周各種移植物未見明顯鈣化；術后8、12 周，TEB 和FTEB 移植裸鼠皮下可以實現(xiàn)較好的異位成骨。通過X線片評分、CT 值比較移植物鈣化程度，TEB 和FTEB 差異無統(tǒng)計學意義（P gt; 0.05），而DBM 未見明顯鈣化。HE 染色示TEB 和FTEB 出現(xiàn)鈣化，DBM 降解吸收。 結(jié)論 FTEB 與TEB 具有相似的成骨活性，為TEB 的儲存和運輸提供了一種新的策略和方法。
目的 為解決組織工程中種子細胞數(shù)量不足及為組織工程種子細胞研究提供標準細胞，建立永生化hBMSCs（MSCxj）系，進一步探討MSCxj 的異位成骨能力。 方法 取凍存復蘇后生長良好的第35 代和第128 代MSCxj，擴增培養(yǎng)至2 109 個，分別與牛松質(zhì)骨復合培養(yǎng)，作為A、B 組（n=12），C 組為單純牛松質(zhì)骨（n=12）。成骨誘導培養(yǎng)48 h 和18 d 時行掃描電鏡觀察細胞在材料上的生長情況。于18 只4 ～ 6 周齡裸鼠背部兩側(cè)皮下各作一3 mm小切口，將3 組共36 個標本采用組內(nèi)隨機、組間兩兩配對分別植入切口內(nèi)。處死動物前分別行四環(huán)素熒光標記。于術后4、8、12周各組分別取4 個標本行HE、麗春紅三色、四環(huán)素熒光染色、鼠抗人骨鈣素單克隆抗體免疫組織化學染色觀察，并行形態(tài)學定量分析。 結(jié)果 細胞- 異種骨復合培養(yǎng)48 h，掃描電鏡觀察見A、B 組細胞貼附生長良好；18 d 可見大量合成的絲狀細胞外基質(zhì)及細小顆粒樣分泌物，并覆蓋細胞。裸鼠皮下埋植實驗：HE、麗春紅三色、四環(huán)素熒光染色觀察示，術后4 周A、B 組標本成骨不明顯，8 周A、B 組標本周邊及異種骨內(nèi)部孔隙有類骨基質(zhì)沉積，12 周A、B 組標本成骨增加，A、B 組間成骨情況比較無明顯差異；C 組各時間點均未見骨質(zhì)形成。鼠抗人骨鈣素單克隆抗體免疫組織化學染色顯示，A、B 組8 周及12 周骨陷窩內(nèi)骨鈣素染色呈陽性。形態(tài)學定量分析顯示，術后8 周A、B組骨長入率分別為5.64% ± 2.68%和4.92% ± 2.95%，術后12 周分別為13.94% ± 2.21% 和14.34% ± 3.46%，兩組間比較差異均無統(tǒng)計學意義（P gt; 0.05）；組內(nèi)術后12周骨長入率均高于術后8 周，差異有統(tǒng)計學意義（P lt; 0.05）。 結(jié)論 MSCxj 與原代培養(yǎng)hBMSCs 一樣具有良好的異位成骨能力，可作為骨組織工程的種子細胞進行相關實驗及臨床研究。
目的 探討以醫(yī)用多孔高密度聚乙烯（high-density polyethylene，HDPE，商品名為Medpor)為內(nèi)支撐，外裹聚羥基乙酸（polyglycolic acid,PGA）的支架，接種軟骨細胞后,于裸鼠體內(nèi)構(gòu)建組織工程睪丸假體的可行性及特點。方法 取新生雌性長楓雜交仔豬1只，取四肢大關節(jié)表面軟骨，制備密度為5×107/ml的軟骨細胞懸液。將其接種于長短半徑分別為6mm和4mm的Medpor，外裹2mm PGA的支架，體外培養(yǎng)2周。取4周齡BALB/C裸鼠10只，隨機分為兩組(n=5) 。實驗組：采用制備的細胞支架復合物植入裸鼠背部皮下；對照組：采用Medpor-PGA復合支架植入裸鼠皮下。8周后處死裸鼠取材，行大體觀察、組織學及免疫組織化學觀察。結(jié)果 大體觀察：實驗組標本形狀與體積未發(fā)生變化，色澤及彈性與正常軟骨相似，軟骨與Medpor接合緊密；對照組無軟骨形成，外包裹纖維樣組織。實驗組：HE染色見軟骨內(nèi)存在大量成熟的軟骨陷窩，無血管長入，部分PGA尚未降解完全；甲苯胺藍染色示細胞外基質(zhì)具有異染特性；藏紅花染色示基質(zhì)中大量蛋白聚糖沉積；Ⅱ型膠原免疫組織化學染色呈強陽性表達。對照組：Medpor被大量富含血管的纖維組織包裹。結(jié)論 利用Medpor與PGA復合的支架，接種軟骨細胞后，可于體內(nèi)構(gòu)建出具有預構(gòu)睪丸形態(tài)且組織學良好的Medpor-軟骨復合體。
【摘要】 目的 觀察低頻超聲（20 kHz）輻照聯(lián)合靜脈注射微泡造影劑SonoVue對裸鼠前列腺癌（Du145）移植瘤的抑瘤效應，并探討其可能的抑瘤機制?！》椒ā⊥ㄟ^細胞移植和瘤塊移植方法建立24只裸鼠前列腺癌Du145移植瘤模型，隨機分為超聲微泡組、單純超聲組、單純微泡組和對照組，每組各6只。超聲微泡組：尾靜脈注射0.2 mL SonoVue的同時對瘤體行20 kHz超聲輻照，輻照強度200 mW/cm2；單純超聲組：尾靜脈注射生理鹽水0.2 mL，同時超聲輻照2 min；單純微泡組：尾靜脈注射SonoVue 0.2 mL同時行假照，各組均隔天1次，共3次，對照組不做任何處理。治療后測量瘤體大小，繪制瘤體生長曲線，計算抑瘤率。首次治療后14 d剝離瘤體，通過光學顯微鏡、電子顯微鏡觀察腫瘤組織病理改變。免疫組織化學方法觀察CD34陽性染色血管，計算腫瘤微血管密度（micro vessel density，MVD），比較各組間MVD的差異。 結(jié)果 24只裸鼠均成功植瘤。治療后超聲微泡組瘤體體積均數(shù)明顯小于其他3組（Plt;0.05），抑瘤率為62.7%。光學顯微鏡下超聲微泡組瘤體組織大部分損傷壞死，電子顯微鏡下超聲微泡組腫瘤內(nèi)微血管的內(nèi)皮細胞損傷，線粒體腫大，基底膜斷裂。超聲微泡組瘤體內(nèi)CD34陽性染色微血管數(shù)減少，其MVD值顯著低于其他各組?！〗Y(jié)論 20 kHz低頻超聲輻照聯(lián)合微泡造影劑SonoVue可有效抑制裸鼠人前列腺癌移植瘤的生長，其抑瘤機制可能是通過超聲空化效應破壞腫瘤的微血管實現(xiàn)的。【Abstract】 Objective To investigate the anti-tumor effect induced by low-frequency ultrasound (20 kHz) radiation combined with intravenous injection of microbubbles on human prostate carcinoma xenograft in nude mice, and to discuss its probable mechanism. Methods Human prostate carcinoma xenograft model in 24 nude mice were established with human prostate carcinoma Du145 cells inoculation and sub-graft through mice, which were randomly divided into ultrasound+microbubble, ultrasound, microbubble, and control group, with 6 mice in each group. In the ultrasound+microbubble group, 0.2 mL SonoVue was injected intravenously, followed by 20 kHz ultrasound exposure of 200 mW/cm2 at every other day for 3 times totally. Mice in the ultrasound group and the microbubbles group were only treated with ultrasound radiation and microbubbles injection, respectively. The volume of gross tumors was measured, and tumor growth curve was drawn. The ratio of anti-tumor growth was calculated. The mice were sacrificed 14 days after the last ultrasound exposure. Specimens of the exposed tumor tissues were obtained and observed pathologically under light microscope and transmission electron microscope. CD34 positive vessels were counted in all the tumor slices by immunohistochemistry, and the micro-vessels density（MVD）of the tumor was also calculated. Results Du145 prostate tumor model was successfully established in all the mice. The average gross tumor volume of the ultrasound+microbubble group was significant lower compared with the other two groups after treatment (Plt;0.05), and the ratio of anti-tumor growth was 62.7%. Histological examination showed signs cell injury in the ultrasound+microbubble group. Electron microscopic examination revealed that the endothelium of vessels in the tumor was injured. The amount of CD34 positive vessels and MVD of the ultrasound+microbubble group was less than that of the other two groups. Conclusion The low-frequency ultrasound of 20 kHz exposure combined with microbubbles can be used to ablate human prostate carcinoma xenograft in nude mice, which is probably realized through micro-vessels destroyed by cavitation effect of ultrasound.