華西醫(yī)學(xué)期刊出版社
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找到 作者 包含"邢士超" 1條結(jié)果
  • 可誘導(dǎo)表達(dá)hBMP-2 的慢病毒載體構(gòu)建及其在人臍血間充質(zhì)干細(xì)胞中的表達(dá)

    目的 構(gòu)建可誘導(dǎo)表達(dá)hBMP-2 的慢病毒載體,并研究hBMP-2 在人臍血間充質(zhì)干細(xì)胞(human umbilical cord blood mesenchymal stem cells,HUMSCs)中的可誘導(dǎo)性表達(dá)。 方法 以pcDNA-hBMP-2 為模板,通過(guò)PCR 反應(yīng)獲取hBMP-2,運(yùn)用GATEWAY 技術(shù)構(gòu)建pLV/EXPN2-Neo-TRE-hBMP-2、pLV/EXPN2-Puro-EF1A- 反向反式激活因子(reverse transactivator,rtTA),通過(guò)PCR 鑒定重組慢病毒載體構(gòu)建。將重組慢病毒與輔助質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)染293FT 細(xì)胞,包裝成能表達(dá)hBMP-2 的可控性慢病毒,并測(cè)定病毒滴度。用病毒轉(zhuǎn)染HUMSCs,使用強(qiáng)力霉素進(jìn)行誘導(dǎo),分別在相同誘導(dǎo)時(shí)間(48 h)不同誘導(dǎo)濃度(0、10、100 ng/mL,1、10、100 μg/mL)及不同誘導(dǎo)時(shí)間(12、24、48、72 h)相同誘導(dǎo)濃度(10 μg/mL)兩種情況下用ELISA 法測(cè)定hBMP-2 的表達(dá)情況。對(duì)轉(zhuǎn)染前后的HUMSCs 進(jìn)行成骨誘導(dǎo),用茜素紅染色法觀察礦化物結(jié)節(jié)形成情況。 結(jié)果 成功構(gòu)建了攜帶hBMP-2 的可控性慢病毒載體pLV/EXPN2-Neo-TRE-hBMP-2、pLV/EXPN2-Puro-EF1A-rtTA,并獲得相應(yīng)的病毒,病毒滴度分別為3.5 × 108 TU/mL 和9.5 × 107 TU/mL;病毒轉(zhuǎn)染HUMSCs 后,HUMSCs 可通過(guò)強(qiáng)力霉素的誘導(dǎo)可控性表達(dá)hBMP-2。在相同誘導(dǎo)時(shí)間情況下,強(qiáng)力霉素10 μg/mL 時(shí)誘導(dǎo)表達(dá)最強(qiáng);而在相同誘導(dǎo)濃度下,hBMP-2 的表達(dá)在誘導(dǎo)48 h 達(dá)峰值。HUMSCs 成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)2 周后,茜素紅染色示胞漿中有大量紅色的鈣化基質(zhì)沉積。 結(jié)論 通過(guò)GATEWAY 技術(shù)可以建立攜帶hBMP-2 目的基因的可控性慢病毒載體,為進(jìn)一步研究hBMP-2 誘導(dǎo)HUMSCs 成骨分化治療骨壞死模型奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ),并提供了一種新的實(shí)驗(yàn)思路。

    發(fā)表時(shí)間:2016-08-31 05:43 導(dǎo)出 下載 收藏 掃碼
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