目的 體外研究藻酸鍶凝膠作為骨組織工程支架材料的應(yīng)用潛力，為可注射骨組織工程支架材料的制備提供依據(jù)。 方法 制備2.0wt%藻酸鈉溶液，分別與0.2 mol/L SrCl2及CaCl2膠凝液離子交聯(lián)形成藻酸鍶和藻酸鈣凝膠，掃描電鏡觀察微觀結(jié)構(gòu)并測其壓縮模量、溶脹率及降解率。采用全骨髓培養(yǎng)法分離培養(yǎng)兔BMSCs并鑒定，將第5代BMSCs分別接種于藻酸鍶凝膠（實(shí)驗(yàn)組）和藻酸鈣凝膠（對照組），觀察其生長、黏附及增殖情況；兩組凝膠來源的細(xì)胞成骨誘導(dǎo)后采用細(xì)胞化學(xué)法檢測ALP活性，熒光定量RT-PCR檢測成骨相關(guān)基因Osterix（OSX）、Ⅰ型膠原、Runx2 mRNA表達(dá)，茜素紅染色、Von Kossa染色檢測鈣鹽沉積情況，并設(shè)同法制備的藻酸鈣凝膠來源的BMSCs作為空白對照組。 結(jié)果 藻酸鍶與藻酸鈣凝膠微觀結(jié)構(gòu)相似，均有均勻的孔隙結(jié)構(gòu)；藻酸鍶及藻酸鈣凝膠壓縮模量分別為（186.53 ± 8.37）、（152.14 ± 7.45）kPa，比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=6.853，P=0.002）；溶脹率分別為14.32% ± 1.53%和15.25% ± 1.64%，比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=0.737，P=0.502）；兩種凝膠的體外降解性均較好，第20、25、30天藻酸鍶凝膠的降解率明顯低于藻酸鈣凝膠（P lt; 0.05）。BMSCs于兩組凝膠中1～4 d時(shí)呈懸浮生長，之后逐漸黏附生長并形成大量細(xì)胞集落。三維培養(yǎng)第21天，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞的DNA含量為（4.38 ± 0.24）g，顯著高于對照組的（3.25 ± 0.21）g（t=8.108，P=0.001）。成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)第12天，實(shí)驗(yàn)組ALP活性為（15.28 ± 1.26）U/L，顯著高于對照組的（12.07 ± 1.12）U/L（P lt; 0.05）。實(shí)驗(yàn)組OSX、Ⅰ型膠原、 Runx2 mRNA相對表達(dá)量均高于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P lt; 0.05）。成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)第21天，兩組茜素紅染色及Von Kossa染色均可見鈣鹽沉積，實(shí)驗(yàn)組的鈣結(jié)節(jié)數(shù)量及磷酸鹽沉積面積均顯著高于對照組（P lt; 0.05）。 結(jié)論 藻酸鍶凝膠具有優(yōu)良的理化特性，對BMSCs增殖及成骨分化有顯著促進(jìn)作用，可作為可注射骨組織工程支架材料。
目的 構(gòu)建人microRNA-210（miR-210）慢病毒重組載體并轉(zhuǎn)染人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞株（human umbilical vein endothelial cells 12，HUVE-12），探討其過表達(dá)對HUVE-12 成血管的影響，為研究血管再生機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ汀７椒?構(gòu)建pGCSIL-GFP-pre-miR-210 重組質(zhì)粒表達(dá)載體并轉(zhuǎn)染HUVE-12，熒光顯微鏡觀察GFP 陽性表達(dá)細(xì)胞數(shù)及實(shí)時(shí)熒光定量PCR 法檢測miR-210 表達(dá)變化；細(xì)胞分為空病毒對照組（LV-GFP 對照組）和miR-210 轉(zhuǎn)染組（LV-miR-210-GFP 組），流式細(xì)胞儀檢測各組細(xì)胞ephrinA3 表達(dá)變化；ELISA 檢測細(xì)胞培養(yǎng)上清中VEGF 含量；將兩組細(xì)胞分別接種于Matrigel 觀察血管形成能力。 結(jié)果 重組載體經(jīng)酶切、測序鑒定正確，GFP 表達(dá)強(qiáng)度在轉(zhuǎn)染后48 ～ 72 h 達(dá)峰值；實(shí)時(shí)熒光定量PCR 檢測結(jié)果顯示：LV-miR-210-GFP 組miR-210 表達(dá)水平較LV-GFP 對照組增加9.72 倍（t= —11.10，P=0.00）。流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果顯示LV-miR-210-GFP 組ephrinA3 陽性細(xì)胞率為12.52% ± 0.67%，明顯較LV-GFP 對照組（73.22% ± 1.45%）降低（t= —66.12，P=0.00）；ELISA 檢測結(jié)果顯示LV-miR-210-GFP 組細(xì)胞上清中VEGF 含量顯著高于LV--GFP 對照組（[ 305.29 ± 16.52）pg/mL vs.（42.52 ± 3.11）pg/mL]（t= —27.06，P=0.00）；血管形成能力實(shí)驗(yàn)顯示LV-miR-210-GFP 組毛細(xì)血管管腔數(shù)為17.33 ± 6.33，較LV-GFP 對照組（6.33 ± 2.33）顯著增加（t= —2.83，P=0.04）。 結(jié)論 成功構(gòu)建miR-210 慢病毒重組載體，并能在HUVE-12 中穩(wěn)定表達(dá)，過表達(dá)miR-210 能明顯增強(qiáng)HUVE-12 血管形成能力，為進(jìn)一步研究miR-210 調(diào)控血管新生的分子機(jī)制奠定了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
免疫熒光可定性分析細(xì)胞內(nèi)蛋白核轉(zhuǎn)位現(xiàn)象, NF-κB/p65蛋白核轉(zhuǎn)位提示NF-κB信號通路的活化, 我們嘗試運(yùn)用自主研發(fā)設(shè)計(jì)的免疫熒光分析軟件計(jì)算熒光圖像中胞核和胞質(zhì)位置的熒光值變化, 定量分析核轉(zhuǎn)位情況, 并通過蛋白質(zhì)免疫印跡法驗(yàn)證軟件分析結(jié)果。應(yīng)用該軟件分析內(nèi)毒素誘導(dǎo)0.5、1、2和4 h后原代人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的NF-κB信號通路活化, 結(jié)果提示2 h為核轉(zhuǎn)位高峰期, 與蛋白質(zhì)免疫印跡法驗(yàn)證結(jié)果一致, 表明自主研發(fā)的免疫熒光分析軟件可應(yīng)用于免疫熒光的定量分析。