【摘要】 目的 探討骨形成蛋白-2（bone morphogenetic protein-2，BMP-2）對(duì)室管膜前下區(qū)（anterior subventricular zone，SVZa）神經(jīng)干細(xì)胞DLX5表達(dá)的影響。 方法 體外培養(yǎng)SVZa神經(jīng)干細(xì)胞，用BMP-2及其拮抗劑Noggin誘導(dǎo)SVZa神經(jīng)干細(xì)胞，分別用免疫熒光染色和逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）檢測(cè)DLX5表達(dá)變化?！〗Y(jié)果 BMP-2組SVZa神經(jīng)干細(xì)胞DLX5蛋白表達(dá)和DLX5mRNA表達(dá)水平明顯高于對(duì)照組（Plt;0.05），且該效應(yīng)能被其拮抗劑Noggin特異性地抑制?！〗Y(jié)論 BMP-2是DLX5上游調(diào)節(jié)基因，可促進(jìn)SVZa神經(jīng)干細(xì)胞DLX5的表達(dá)。【Abstract】 Objective To investigate the effect of bone morphogenetic protein-2 (BMP-2)on expression of DLX5 of neural stem cells in anterior subventricular zone (SVZa). Methods The neural stem cells of SVZa were separated and cultured in vitro, which were induced by BMP-2 and Noggin.Immunofluorescence staining and RT-PCR were employed to assay the expression of DLX5. Results The percentages of expression of DLX5 protein and DLX5 mRNA in BMP-2 group were much higher than those in the control group (Plt;0.05). And this induction could be specifically blocked by Noggin. Conclusion BMP-2 is an upstream gene of DLX5; BMP-2 can promote the expression of DLX5 of the neural stem cells of SVZa.
目的 構(gòu)建人骨形成蛋白-2（hBMP-2）真核表達(dá)載體pcDNA3.1-hBMP-2，轉(zhuǎn)染人骨髓基質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)，探討基因轉(zhuǎn)染對(duì)其增殖和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）表達(dá)的影響。方法 利用重組DNA和基因克隆技術(shù)構(gòu)建重組載體pcDNA3.1-hBMP-2；細(xì)胞培養(yǎng)和基因轉(zhuǎn)染技術(shù)體外轉(zhuǎn)染人MSCs；免疫細(xì)胞化學(xué)、原位雜交和蛋白印跡法檢測(cè)細(xì)胞BMP-2的表達(dá)；通過(guò)流式細(xì)胞儀和VEGF探針原位雜交分析其對(duì)細(xì)胞增殖和VEGF表達(dá)的影響。結(jié)果 轉(zhuǎn)染后細(xì)胞在mRNA水平和蛋白質(zhì)水平均表達(dá)BMP-2；轉(zhuǎn)染后S期細(xì)胞比例增多，提示細(xì)胞DNA的合成增加；BMP-2基因轉(zhuǎn)染上調(diào)細(xì)胞VEGF的表達(dá)。結(jié)論 在脂質(zhì)體介導(dǎo)下，pcDNA3.1-hBMP-2轉(zhuǎn)染MSCs獲得成功?；蜣D(zhuǎn)染后能促進(jìn)細(xì)胞增殖并將通過(guò)使VEGF的表達(dá)增加促進(jìn)血管再生，為進(jìn)一步骨缺損的基因治療及構(gòu)建組織工程骨奠定了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
目的 構(gòu)建人骨形成蛋白 - 2 (BMP- 2 )和骨保護(hù)素 (OPG)的共表達(dá)真核載體 ,研究其在小鼠成肌細(xì)胞C2 C12中的表達(dá)?！》椒ā∫匀斯侨饬黾?xì)胞系 MG6 3的總 RNA為模板 ,RT- PCR法獲得人 OPG的編碼區(qū) c DNA,克隆入真核表達(dá)載體 p IRES2 - EGFP的多克隆位點(diǎn) ,再將人 BMP- 2的編碼區(qū) c DNA克隆入 p IRES2 - EGFP中的 Bst X 位點(diǎn) ,構(gòu)建 BMP- 2和 OPG的雙順?lè)醋诱婧吮磉_(dá)載體 p IRES2 - BMP- 2 - OPG,在陽(yáng)離子脂質(zhì)體介導(dǎo)下轉(zhuǎn)染 C2 C12細(xì)胞 ,Western blot法檢測(cè) BMP- 2和 OPG的表達(dá)?！〗Y(jié)果 1獲得人 OPG編碼區(qū)全長(zhǎng) c DNA。 2構(gòu)建人 BMP- 2和 OPG的雙順?lè)醋诱婧吮磉_(dá)載體 p IRES2 - BMP- 2 - OPG。 3經(jīng) Western blot檢測(cè) ,p IRES2 - BMP- 2 - OPG轉(zhuǎn)染 C2 C12細(xì)胞后 ,細(xì)胞可穩(wěn)定表達(dá) BMP- 2和 OPG?！〗Y(jié)論 構(gòu)建了人 BMP- 2和 OPG的共表達(dá)真核載體 ,并可在C2C12細(xì)胞中穩(wěn)定表達(dá),為應(yīng)用BMP-2和OPG進(jìn)行骨質(zhì)疏松等疾病的治療研究奠定了基礎(chǔ)。
目的 探討穩(wěn)定表達(dá)人骨形成蛋白-2(hBMP-2)基因的成纖維細(xì)胞是否具有體內(nèi)誘導(dǎo)成骨能力。方法 構(gòu)建重組真核表達(dá)載體pcDNA3-hBMP-2，在脂質(zhì)體介導(dǎo)下，將其導(dǎo)入NIH3T3細(xì)胞，通過(guò)G418篩選獲得陽(yáng)性克隆，并繼續(xù)培養(yǎng)4周，用細(xì)胞原位雜交和免疫組織化學(xué)方法觀察hBMP-2基因在NIH3T3細(xì)胞內(nèi)的穩(wěn)定表達(dá)，并觀察了穩(wěn)定表達(dá)hBMP-2的成纖維細(xì)胞堿性磷酸酶(ALP)活性的變化，將穩(wěn)定表達(dá)hBMP-2的成纖維細(xì)胞植入裸鼠肌袋內(nèi)觀察其體內(nèi)誘導(dǎo)成骨作用。結(jié)果 成功構(gòu)建重組真核表達(dá)載體pcDNA3-hBMP-2，經(jīng)細(xì)胞原位雜交和免疫組織化學(xué)證實(shí)，轉(zhuǎn)染pcDNA3-hBMP-2后的NIH3T3細(xì)胞內(nèi)有大量hMP-2 mRNA的轉(zhuǎn)錄及其蛋白的穩(wěn)定表達(dá)，穩(wěn)定表達(dá)hBMP-2的成纖維細(xì)胞ALP活性顯著上升，植入裸鼠肌袋內(nèi)4周有大量軟骨形成。結(jié)論 穩(wěn)定表達(dá)hBMP-2的成纖維細(xì)胞具有體內(nèi)誘導(dǎo)成骨能力。
目的 探討和比較3種鈣磷陶瓷材料HA、TCP、HA/TCP復(fù)合重組人骨形成蛋白-2(rhBMP-2)體內(nèi)異位成骨效果，為臨床應(yīng)用提供依據(jù)。方法 取35只3月齡Wistar大鼠，將復(fù)合rhBMP-2的3種鈣磷陶瓷材料(1∶1) 植于鼠背部肌袋內(nèi)，未復(fù)合rhBMP-2的上述3種單純陶瓷材料為對(duì)照組。術(shù)后2、4和8周取材，測(cè)定植入物堿性磷酸酶（ALP）活性，通過(guò)HE染色和計(jì)算機(jī)圖像分析進(jìn)行組織學(xué)和組織計(jì)量學(xué)觀察，比較新生骨組織的形成。結(jié)果 術(shù)后2、4周復(fù)合植入物ALP活性測(cè)定從高到低依次為HA、HA/TCP、TCP，但在相同rhBMP-2劑量下，其差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），與相對(duì)應(yīng)單純支架材料比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；組織學(xué)和組織計(jì)量學(xué)檢測(cè)結(jié)果顯示各復(fù)合材料組均有新骨形成，成骨量隨時(shí)間推移而增加，2周時(shí)以HA/rhBMP-2成骨量較多，但3組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；8周時(shí)新骨形成以雙相陶瓷HA/TCP最佳，相關(guān)參數(shù)和圖像分析有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），成骨量8周較2、4周多，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；3種單純支架材料各觀察期均無(wú)骨樣組織形成。結(jié)論 雙相陶瓷材料HA/TCP是攜帶rhBMP-2的鈣磷陶瓷良好支架材料。
目的 評(píng)價(jià)腺病毒介導(dǎo)的人骨形成蛋白 - 2基因 (Adv- h BMP- 2 )轉(zhuǎn)染人骨髓間質(zhì)干細(xì)胞 (MSCs)的誘導(dǎo)成骨能力。方法 從人骨髓中分離培養(yǎng)獲取 MSCs,分為三組 :1Adv- h BMP- 2轉(zhuǎn)染細(xì)胞組 ;2 Adv- βgal轉(zhuǎn)染細(xì)胞組 ;3未轉(zhuǎn)染細(xì)胞組。分別于體外行 Western immunoblot試驗(yàn)、堿性磷酸酶 (AL P)和 Von Kossa染色、AL P定量測(cè)定 ,以及裸鼠肌內(nèi)誘導(dǎo)成骨試驗(yàn)。共 9只裸鼠 ,雙側(cè)股后肌群內(nèi)注射 ,每組 6側(cè)。結(jié)果 Adv- h BMP- 2組 MSCs可分泌 BMP- 2蛋白 ;轉(zhuǎn)染后第 9天 AL P染色多數(shù)細(xì)胞為陽(yáng)性 ,其它兩組 AL P染色陽(yáng)性細(xì)胞少見(jiàn) ;AL P活性第 3天開(kāi)始升高 ,12天達(dá)高峰為 14 .76單位 ,與其它兩組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (Plt;0 .0 5 ) ;于第 2 1天后出現(xiàn)鈣結(jié)節(jié) ,而其它兩組未見(jiàn)。裸鼠肌內(nèi)注射后 4周 Adv- h BMP- 2組 X線片均有異位成骨 ,Adv- βgal轉(zhuǎn)染細(xì)胞組未見(jiàn)明顯成骨 ,未轉(zhuǎn)染細(xì)胞組僅有少量骨形成。組織學(xué)檢查發(fā)現(xiàn) :Adv- h BMP- 2組也可見(jiàn)典型的板層骨和骨髓腔腔形成，Adv-βga組主要為纖維組織，未轉(zhuǎn)染組也可見(jiàn)散在骨小梁形成功之路。 結(jié)論 Adv-hMBP-2基因轉(zhuǎn)染可誘導(dǎo)人骨髓間質(zhì)干細(xì)胞成骨。
目的 研制新型具有誘導(dǎo)成骨活性的異種骨植骨材料。方法 在重組合異種骨（RBX）基礎(chǔ)上，以基因重組人骨形成蛋白-2（ rhBMP-2）取代從牛皮質(zhì)骨中提取的牛BMP，與去抗原牛松質(zhì)骨載體（BCB）復(fù)合，制成復(fù)合 rhBMP-2的異種骨（ rhBMP2/BCB）；將4周齡雄性BALB/C小鼠60只，隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，于實(shí)驗(yàn)組小鼠左股部肌袋植入rhBMP-2/BCB 骨粒，對(duì)照組小鼠左股部肌袋植入BCB骨粒，術(shù)后7、14及21天取材，通過(guò)組織學(xué)、骨計(jì)量學(xué)方法檢測(cè) rhBMP2/BCB的誘導(dǎo)成骨活性。 結(jié)果 ①實(shí)驗(yàn)組術(shù)后7天在小鼠肌袋可誘導(dǎo)軟骨生成，14天形成編織骨，21天改建成板層骨并形成大量骨髓；對(duì)照組于術(shù)后各時(shí)間點(diǎn)均未見(jiàn)有軟骨及骨形成。②實(shí)驗(yàn)組的堿性磷酸酶活性和鈣含量均高于對(duì)照組，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。結(jié)論 rhBMP-2/BCB具有較好的骨誘導(dǎo)能力，是一種較理想的植骨材料。
目的 評(píng)價(jià)重組人骨形成蛋白-2(rhBMP-2)與膠原復(fù)合物在大鼠顱骨表面的成骨作用。方法 用SD大鼠9只在兩側(cè)顳部各制備一骨膜下袋后，分為實(shí)驗(yàn)側(cè)和對(duì)照側(cè)。右側(cè)植入rhBMP-2與膠原復(fù)合物為實(shí)驗(yàn)側(cè)，左側(cè)植入單純膠原作為對(duì)照，分別于術(shù)后2、4及8周處死動(dòng)物各3只，取標(biāo)本制作脫鈣石蠟切片，觀察成骨情況，并測(cè)量成骨厚度。 結(jié)果 rhBMP-2與膠原復(fù)合物可在顳骨表面通過(guò)膜內(nèi)成骨的方式誘導(dǎo)新骨形成，并與顳骨外板良好結(jié)合，術(shù)后2周，植入物大部分降解吸收，顳骨表面有大量新生骨；術(shù)后4周，植入物完全為新骨代替，顳骨厚度約為厚原度的5倍；術(shù)后8周，新骨更加成熟，顳骨厚度約為原厚度2.8倍。而對(duì)照側(cè)骨質(zhì)在術(shù)后各周均無(wú)明顯增厚。結(jié)論 rhBMP-2與膠原復(fù)合物可作為良好的表面植骨替代材料，并能與植骨床良好結(jié)合。
目的 彌補(bǔ)單純珊瑚無(wú)骨誘導(dǎo)活性、骨修復(fù)能力弱等缺陷，為臨床提供理想的骨移植替代材料。方法 將珊瑚與膠原和重組人骨形成蛋白２（ｒｈＢＭＰ２）復(fù)合，制備珊瑚／膠原／ｒｈＢＭＰ２復(fù)合人工骨，將其植入大鼠背部肌肉陷窩，以珊瑚／膠原和珊瑚／ｒｈＢＭＰ２復(fù)合人工骨植入作對(duì)照；取材后通過(guò)組織學(xué)方法和圖像分析評(píng)價(jià)其骨誘導(dǎo)活性。結(jié)果 珊瑚／膠原／ｒｈＢＭＰ２植入后１周，在局部誘導(dǎo)出軟骨細(xì)胞分化和軟骨基質(zhì)形成；植入后４周，形成含骨髓的板層骨；誘導(dǎo)成骨的量有明顯的ｒｈＢＭＰ２劑量依賴性（Ｐ＜０．０１）；而珊瑚／膠原和珊瑚／ｒｈＢＭＰ２植入?yún)^(qū)均無(wú)骨或軟骨形成。結(jié)論 珊瑚／膠原／ｒｈＢＭＰ２復(fù)合人工骨具有良好的異位誘導(dǎo)成骨活性，是一種較理想的骨移植替代材料。