目的 構(gòu)建nesprin蛋白siRNA慢病毒載體(LV-siNesprin),感染骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs),觀察nesprin蛋白對(duì)MSCs的影響?!》椒ā♂槍?duì)nesprin靶基因序列設(shè)計(jì)并合成4對(duì)miRNA oligo,并將4對(duì)oligo退火成雙鏈DNA,測(cè)序鑒定。將4種miRNA干擾質(zhì)粒(SR-1、SR-2、SR-3、SR-4)轉(zhuǎn)入大鼠血管平滑肌細(xì)胞,用反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)和蛋白印跡法(Western blotting)檢測(cè)干擾效應(yīng),篩選最佳干擾序列;將最佳干擾序列和pDONR221載體進(jìn)行重組反應(yīng),獲得含干擾序列的入門(mén)載體,再將入門(mén)載體和慢病毒表達(dá)的目的載體pLenti6/V5-DEST進(jìn)行重組反應(yīng)獲得含干擾序列的LV-siNesprin+綠色熒光蛋白(GFP),包裝慢病毒,測(cè)定病毒滴度。LV-siNesprin+GFP轉(zhuǎn)染MSCs,Western blotting鑒定比較nesprin蛋白表達(dá)情況(分為L(zhǎng)V-siNesprin+GFP組、GFP對(duì)照組和正常細(xì)胞組),用4,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)染色觀察細(xì)胞核形態(tài)改變和四甲基偶氮唑鹽(MTT)法檢測(cè)MSCs感染LV-siNesprin后24 h、48 h、72 h和96 h的增殖情況(分為L(zhǎng)V-siNesprin+GFP組、GFP對(duì)照組和正常細(xì)胞組)?!〗Y(jié)果 測(cè)序證實(shí)合成的4對(duì)miRNA oligo正確,RT-PCR和Western blotting篩選出最佳干擾miRNA質(zhì)粒SR-3,成功構(gòu)建LV-siNesprin,包裝慢病毒,病毒懸液的活性滴度為1×106 ifu/ml。LV-siNesprin轉(zhuǎn)染MSCs后,nesprin蛋白表達(dá)明顯下降,出現(xiàn)細(xì)胞核融合、核碎裂等形態(tài)學(xué)改變;MTT法檢測(cè)顯示,LV-siNesprin+GFP組MSCs增殖速度較GFP對(duì)照組和正常細(xì)胞組減慢?!〗Y(jié)論 Nesprin蛋白對(duì)MSCs核膜穩(wěn)定維持核膜空間結(jié)構(gòu)起作用,并利于細(xì)胞增殖更新。