四川大學(xué)華西醫(yī)院腫瘤生物治療研究室魏于全教授、鞏長(zhǎng)旸研究員和姚少華研究員團(tuán)隊(duì)于2017年1月在ACS Nano（影響因子：13.903）發(fā)表文章“Artificial Virus Delivers CRISPR-Cas9 System for Genome Editing of Cells in Mice”（點(diǎn)擊下方二維碼即可閱讀原文）。
CRISPR/Cas9系統(tǒng)是細(xì)菌和古細(xì)菌在長(zhǎng)期演化過(guò)程中形成的一種適應(yīng)性免疫防御，可用來(lái)對(duì)抗入侵的病毒及外源DNA。經(jīng)過(guò)科學(xué)家們的一系列改造以后，CRISPR/Cas9成為新一代基因編輯工具，可以對(duì)靶基因進(jìn)行特定修飾，具有廣闊的應(yīng)用前景。但目前，其體內(nèi)應(yīng)用仍存在諸多問(wèn)題，也使其臨床轉(zhuǎn)化受到局限。
為了解決CRISPR/Cas9系統(tǒng)體內(nèi)遞送遇到的難題，華西醫(yī)院腫瘤生物治療研究室魏于全教授、鞏長(zhǎng)旸研究員和姚少華研究員設(shè)計(jì)并構(gòu)建了一種新型的人工病毒基因載體用于CRISPR/Cas9系統(tǒng)的體內(nèi)遞送。該人工病毒的設(shè)計(jì)受天然病毒“核-殼”結(jié)構(gòu)的啟發(fā)，由具有帶正電的氟化小分子聚乙烯亞胺內(nèi)核（PF33）和多功能的高分子外殼（RGD-R8-PEG-HA）組成。其中，內(nèi)核能夠?qū)^大的CRISPR/Cas9質(zhì)粒（>10 kb）進(jìn)行高效負(fù)載，并對(duì)腫瘤細(xì)胞進(jìn)行高效率轉(zhuǎn)染，同時(shí)保護(hù)質(zhì)粒逃逸溶酶體的降解。RGD-R8-PEG-HA高分子外殼帶負(fù)電，可以掩蔽內(nèi)核正電荷，使人工病毒在血液中更加穩(wěn)定，保護(hù)核酸避免被免疫系統(tǒng)清除；PEG賦予人工病毒系統(tǒng)更長(zhǎng)的體內(nèi)循環(huán)時(shí)間；RGD和HA可靶向腫瘤高表達(dá)的整合素αvβ3和CD44受體，增加人工病毒在腫瘤部位的富集；R8可以增加腫瘤滲透深度，并提高腫瘤細(xì)胞攝??；同時(shí)腫瘤細(xì)胞溶酶體的透明質(zhì)酸酶可以降解外殼中的HA，暴露出帶正電荷的內(nèi)核，促進(jìn)溶酶體逃逸，增強(qiáng)基因編輯效率。
體外轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)表明人工病毒的轉(zhuǎn)染效率明顯高于商用轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000和Lipofectamine 3000，且在有血清干擾情況下，其轉(zhuǎn)染效率依然較高。當(dāng)選擇卵巢癌病人腫瘤組織高表達(dá)的MTH1基因作為治療靶點(diǎn)時(shí)，人工病毒可遞送CRISPR/Cas9成功敲除卵巢癌細(xì)胞中的MTH1基因，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞凋亡，抑制卵巢癌細(xì)胞增殖。在卵巢癌腹腔轉(zhuǎn)移動(dòng)物模型的治療中，人工病毒可在腫瘤部位大量富集，并高效轉(zhuǎn)染腫瘤細(xì)胞，使腫瘤部位的MTH1蛋白表達(dá)降低，凋亡增加，最終顯著抑制了小鼠腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移，且具有較低的脫靶風(fēng)險(xiǎn) (圖1)。
圖1 本研究圖示
專家點(diǎn)評(píng)
錢志勇教授：CRISPR/Cas9系統(tǒng)作為新一代的基因編輯技術(shù)，已經(jīng)成為從基礎(chǔ)研究到臨床應(yīng)用領(lǐng)域非常具有潛力的基因編輯工具。但因需要編碼核酶和sgRNA， CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)的質(zhì)粒較大，一般大于10 kb，因此對(duì)其轉(zhuǎn)染系統(tǒng)提出了較高要求。目前CRISPR/Cas9質(zhì)粒常用的體內(nèi)遞送方式主要有水動(dòng)力高壓注射和病毒遞送等方法。前者在注射時(shí)會(huì)造成瞬時(shí)血壓升高，可能造成器官損傷，在人體內(nèi)很難應(yīng)用；而病毒遞送可能會(huì)遇到基因組整合、免疫原性等問(wèn)題，具有潛在的風(fēng)險(xiǎn)，亟待開(kāi)發(fā)新型遞送系統(tǒng)。魏于全教授、鞏長(zhǎng)旸研究員和姚少華研究員團(tuán)隊(duì)受到天然病毒結(jié)構(gòu)啟發(fā)，創(chuàng)新性地設(shè)計(jì)并構(gòu)建了可以高效轉(zhuǎn)染超大質(zhì)粒（>10 kb）的人工病毒基因載體，在體內(nèi)外遞送CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)，實(shí)現(xiàn)小鼠體內(nèi)高效基因編輯，并在腫瘤模型中取得了良好的治療效果。該研究為CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)的體內(nèi)應(yīng)用提供了理論依據(jù)和研究基礎(chǔ)，也為超大質(zhì)粒的體內(nèi)遞送提供了潛在新選擇。
錢志勇，博士，四川大學(xué)二級(jí)教授，四川大學(xué)華西醫(yī)院腫瘤生物研究室/生物治療國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室教授、博士生導(dǎo)師，國(guó)家杰出青年基金獲得者、國(guó)家“萬(wàn)人計(jì)劃”科技創(chuàng)新領(lǐng)軍人才，中國(guó)醫(yī)藥生物技術(shù)協(xié)會(huì)納米生物技術(shù)分會(huì)主任委員，擔(dān)任Materials Express、J Biomed Nanotechnol等學(xué)術(shù)期刊主編，擔(dān)任Chinese Chemical Letters、J Biological Engineering副主編。針對(duì)納米生物材料的構(gòu)建及其在腫瘤治療和組織修復(fù)中的應(yīng)用進(jìn)行了長(zhǎng)期的研究，目前已經(jīng)在Chem Soc Rev、Adv Funct Mater、Adv Sci、ACS Nano、Nano Lett、Biomaterials等學(xué)術(shù)期刊以通訊作者發(fā)表SCI論文100余篇。
作者投稿心得
CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)是研究前沿，目前在疾病動(dòng)物模型構(gòu)建、體外功能和機(jī)制研究方面有較多報(bào)道。但其體內(nèi)應(yīng)用，特別是疾病治療方面報(bào)道較少。由于CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)的質(zhì)粒較大（>10 kb），其轉(zhuǎn)染效果較低。本文作者針對(duì)這一難題，查閱了大量文獻(xiàn)，并創(chuàng)新性地設(shè)計(jì)并構(gòu)建了可高效遞送超大質(zhì)粒的人工病毒基因遞送系統(tǒng)，實(shí)現(xiàn)了體內(nèi)靶向和高效基因編輯，并在腫瘤模型治療中取得了較好的治療效果。本文發(fā)表于納米領(lǐng)域著名期刊ACS Nano，該期刊對(duì)論文的創(chuàng)新性有非常高的要求，投稿的文章約只有20%可以送外審。本文歷經(jīng)五輪修改，十余名審稿專家給出了非常有建設(shè)性的意見(jiàn)，作者針對(duì)審稿專家的意見(jiàn)，補(bǔ)充相應(yīng)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，最終得到了所有審稿專家的認(rèn)可。
共同通信作者
魏于全，教授，博士生導(dǎo)師，2003年當(dāng)選中國(guó)科學(xué)院院士；原四川大學(xué)副校長(zhǎng)，華西醫(yī)院臨床腫瘤中心主任與生物治療國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室主任，中國(guó)醫(yī)藥生物技術(shù)協(xié)會(huì)理事長(zhǎng)，國(guó)家生物治療協(xié)同創(chuàng)新中心負(fù)責(zé)人，國(guó)家綜合性新藥研究開(kāi)發(fā)技術(shù)大平臺(tái)負(fù)責(zé)人， Signal Transduction and Targeted Therapy共同主編、Human Gene Therapy 副主編、Current Molecular Medicine副主編；科技部“973” 項(xiàng)目首席科學(xué)家，國(guó)家自然科學(xué)基金創(chuàng)新研究群體負(fù)責(zé)人，教育部“長(zhǎng)江學(xué)者獎(jiǎng)勵(lì)計(jì)劃”特聘教授，1997 年國(guó)家杰出青年科學(xué)基金獲得者，國(guó)家“百千萬(wàn)人才工程”第一、二層次人選，十五“863” 生物與農(nóng)業(yè)技術(shù)領(lǐng)域生物工程技術(shù)主題專家組組長(zhǎng)，十二五“863” 生物與醫(yī)學(xué)領(lǐng)域生物技術(shù)藥物主題專家組成員、原中華醫(yī)學(xué)會(huì)副會(huì)長(zhǎng)、原教育部科學(xué)技術(shù)委員會(huì)生物醫(yī)學(xué)學(xué)部常務(wù)副主任。主要從事腫瘤生物治療的基礎(chǔ)研究、關(guān)鍵技術(shù)開(kāi)發(fā)、產(chǎn)品研發(fā)及臨床治療等，有關(guān)腫瘤微環(huán)境、免疫治療、基因治療與靶向藥物等相關(guān)研究結(jié)果已在多種國(guó)際雜志上發(fā)表SCI論文300多篇。
共同通信作者
鞏長(zhǎng)旸，博士，四川大學(xué)華西醫(yī)院腫瘤生物治療研究室/生物治療國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室研究員、博士生導(dǎo)師，國(guó)家自然科學(xué)基金優(yōu)秀青年基金獲得者，入選主持中組部“萬(wàn)人計(jì)劃”青年拔尖人才支持計(jì)劃，四川省衛(wèi)生和健康委員會(huì)學(xué)術(shù)和技術(shù)帶頭人，中國(guó)抗癌協(xié)會(huì)青年理事會(huì)理事，中國(guó)生物材料學(xué)會(huì)納米生物材料分會(huì)委員會(huì)委員，中國(guó)病理生理學(xué)會(huì)免疫學(xué)專業(yè)委員會(huì)委員，中國(guó)醫(yī)藥生物技術(shù)協(xié)會(huì)造影技術(shù)分會(huì)委員會(huì)委員，中國(guó)抗癌協(xié)會(huì)納米腫瘤學(xué)分會(huì)青年委員會(huì)委員，中國(guó)生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)會(huì)納米醫(yī)學(xué)與工程學(xué)分會(huì)青年委員會(huì)委員，中國(guó)生物物理協(xié)會(huì)納米生物學(xué)分會(huì)青年委員會(huì)委員。主要研究領(lǐng)域?yàn)獒槍?duì)腫瘤治療的新型自組裝基因、疫苗和藥物遞送系統(tǒng)，以通訊或第一作者在Adv Mater、Adv Funct Mater、ACS Nano、Biomaterials等國(guó)際學(xué)術(shù)期刊發(fā)表SCI論文80余篇。
共同通信作者
姚少華，博士，研究員，博士生導(dǎo)師。主要研究方向是應(yīng)用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)進(jìn)行基因功能和基因治療研究；側(cè)重于發(fā)展基于非病毒載體的CRISPR導(dǎo)入系統(tǒng)以及開(kāi)發(fā)基于CRISPR/Cas9的新型基因編輯工具，集中于肝臟相關(guān)的腫瘤和遺傳病的發(fā)病機(jī)制、基因治療研究。多項(xiàng)研究結(jié)果發(fā)表在JBC、ACS Nano、Human Gene Therapy、Neoplasia、Lab Invest等期刊。近年來(lái)，主持多項(xiàng)國(guó)家自然科學(xué)青年基金、面上項(xiàng)目、863計(jì)劃重點(diǎn)項(xiàng)目以及橫向課題等項(xiàng)目。
共同第一作者
博士研究生李玲、宋林江、楊茜和劉小威為該論文的共同第一作者。
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本文編輯：張 敏
本文排版：陳紅梅 張洪雪