四川大學(xué)華西醫(yī)院生物治療國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/腎病研究室邵振華研究員團(tuán)隊(duì)于2019年11月在“Nature Chemical Biology”（影響因子12.15）發(fā)表文章"Structure of an allosteric modulator bound to the CB1 cannabinoid receptor"（長(zhǎng)按下方二維碼即可閱讀全文）。

大麻素受體CB1屬于GPCR（G蛋白偶聯(lián)受體）Class A類家族，在人類神經(jīng)系統(tǒng)中高度表達(dá)，大麻素類藥物通過(guò)激活該類受體進(jìn)而調(diào)節(jié)體內(nèi)的生理反應(yīng)。CB1受體主要分布于中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，是疼痛、癲癇、肥胖癥、抑郁癥、肝纖維化或多發(fā)性硬化癥的治療靶點(diǎn)。CB1的激動(dòng)劑和拮抗劑配體識(shí)別受體的正位位點(diǎn)，分別調(diào)節(jié)信號(hào)通路的開(kāi)和關(guān)。除了正位配體外（激動(dòng)劑和拮抗劑），其別構(gòu)調(diào)節(jié)劑不僅影響大麻素類激動(dòng)劑的結(jié)合，而且同樣具有調(diào)節(jié)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的能力。理解別構(gòu)調(diào)節(jié)劑的分子機(jī)制將有助于我們更好地理解GPCR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的復(fù)雜機(jī)理。

CB1的別構(gòu)調(diào)控分子最早在2005年由Price等人報(bào)道。他們發(fā)現(xiàn)化合物ORG27569不僅能增強(qiáng)CB1的正向激動(dòng)劑CP55940的結(jié)合，更有趣的是，該化合物抑制了下游Gi 蛋白的信號(hào)途徑。為了更好地理解ORG27569作為CB1受體負(fù)向別構(gòu)調(diào)節(jié)劑（NAM）的分子機(jī)理，我們用X射線晶體學(xué)的方法解析了CB1受體-激動(dòng)劑CP55940-ORG27569三元復(fù)合物的三維結(jié)構(gòu)，為該類受體的新型藥物開(kāi)發(fā)和篩選提供了新的思路。

圖1　CB1配體的二維結(jié)構(gòu)　（a）THC，（b）CBD，（c）CP55940和（d）ORG27569

從我們獲得的CB1與激動(dòng)劑和NAM的三元復(fù)合物整體結(jié)構(gòu)來(lái)看，CP55940占據(jù)正位結(jié)合位點(diǎn)，而ORG27569結(jié)合至膜內(nèi)的螺旋外位點(diǎn)（圖2a，b），主要與受體的TM4互作，并且沿著面向脂質(zhì)的疏水表面延伸以接觸TM2（圖2b）。CB1在G蛋白結(jié)合位點(diǎn)處于非活性構(gòu)象（圖2c），TM5和TM6向核心區(qū)域位移，從而導(dǎo)致識(shí)別和結(jié)合G蛋白的區(qū)域大幅度減少。這就解釋了CB1受體在激動(dòng)劑作用下，ORG27569抑制Gi信號(hào)通路的原因。

圖2　CB1結(jié)合CP55940和ORG27569的整體結(jié)構(gòu)　 （a）從膜平面內(nèi)觀看，CB1（藍(lán)色）。 紅色球形為CP55940激動(dòng)劑，黃色球形結(jié)構(gòu)為ORG27569。（b）CB1的靜電表面圖。（c）膜的細(xì)胞內(nèi)側(cè)觀察視角

CB1受體中的兩個(gè)芳香環(huán)殘基（F2003.36和W3566.48）構(gòu)象變化決定了受體的激活與否，被稱為該受體的雙撥動(dòng)開(kāi)關(guān)。在具有ORG27569和CP55940的復(fù)合物中，雙撥動(dòng)開(kāi)關(guān)采用的無(wú)效'off'構(gòu)型（圖3a），類似于在taranabant（反向激動(dòng)劑）識(shí)別的結(jié)構(gòu)，兩個(gè)殘基形成π-π疏水作用，將受體TM3和TM6鎖定在類似失活的構(gòu)象。與激動(dòng)劑結(jié)構(gòu)（圖3b）和激動(dòng)劑-Gi復(fù)合物（圖3c）形成對(duì)比，其中F2003.36側(cè)鏈從TM5旋轉(zhuǎn)140°并與TM2接觸。這種變化伴隨著另一個(gè)扳動(dòng)開(kāi)關(guān)殘基W3566.48遠(yuǎn)離激動(dòng)劑的運(yùn)動(dòng)，伴隨著TM6的向外運(yùn)動(dòng)，兩個(gè)殘基間的作用力被破壞，使其受體處于激活構(gòu)象（圖3b，c）?？傊谖覀兊难芯恐?，發(fā)現(xiàn)ORG27569和CP55940結(jié)合的CB1三元復(fù)合物處于一種中間構(gòu)象，在該構(gòu)象中，正位口袋在活動(dòng)狀態(tài)下會(huì)收縮以適合激動(dòng)劑（圖3b）；然而，撥動(dòng)開(kāi)關(guān)未觸發(fā)（圖3a），阻礙了TM6的移動(dòng)。進(jìn)一步在結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)上揭示了別構(gòu)調(diào)節(jié)劑對(duì)CB1受體的調(diào)節(jié)作用。

圖3　CB1受體在不同狀態(tài)下的雙撥動(dòng)開(kāi)關(guān)（F2003.36和W3566.48）（a）CP55940 / ORG27569結(jié)合的CB1和taranabant結(jié)合的CB1的疊加（PDB 5U09）。（b）CP55940 / ORG27569結(jié)合的CB1和AM11542結(jié)合的CB1（PDB 5XRA）的疊加。（c）CP55940 / ORG27569結(jié)合的CB1和Fubinaca / Gibound的CB1（PDB 6N4B）的疊加

最重要的是，我們?cè)谘芯恐邪l(fā)現(xiàn)了一個(gè)全新的GPCR別構(gòu)調(diào)節(jié)位點(diǎn)，這與之前發(fā)現(xiàn)的GPCR別構(gòu)調(diào)節(jié)位點(diǎn)不同。ORG27569的氯吲哚基團(tuán)緊靠W2414.50的吲哚側(cè)鏈，而酰胺鍵聯(lián)的哌啶基苯基鏈則延伸穿過(guò)受體外部，緊靠T2424.51和I2454.54（圖4a）。W2414.50殘基是A類GPCR中最保守的殘基之一（圖4c），該位點(diǎn)為GPCR別構(gòu)調(diào)節(jié)位點(diǎn)和藥物設(shè)計(jì)提供了依據(jù)和結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。

圖４　別構(gòu)調(diào)節(jié)劑ORG27569與CB1受體識(shí)別細(xì)節(jié)　（a）ORG27569配體（黃色）在4.5?以內(nèi)的接觸殘基（藍(lán)色）。（b）與激動(dòng)劑結(jié)合的CB1（PDB 5XRA）與膽固醇在同一口袋的等效位點(diǎn)。（c）來(lái)自不同A類GPCR的TM4的多序列比對(duì)，顯示色氨酸（W）在4.50位保守。（d）在ORG27569結(jié)合位點(diǎn)上，CP55940結(jié)合的CB1（藍(lán)色）、Taranabant結(jié)合的CB1（PDB 5U09，灰色）和Fubinaca結(jié)合的CB1（PDB 6N4B，橙色）的結(jié)構(gòu)重疊

總之，該論文解釋了ORG27569作為CB1受體負(fù)向別構(gòu)調(diào)節(jié)劑的分子機(jī)制，為理解CB1受體的作用機(jī)理打開(kāi)了新的“一扇窗”，同時(shí)為該類受體的新型藥物開(kāi)發(fā)和篩選提供了新的思路。

楊勝勇教授：大麻作為藥用價(jià)值已有幾千年的歷史，主要通過(guò)作用到大麻素受體進(jìn)而調(diào)節(jié)體內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，達(dá)到疾病治療的目的。人體內(nèi)源大麻素受體有CB1和CB2兩種。其中， CB1受體主要位于腦、脊髓與外周神經(jīng)系統(tǒng)中，具有GPCR經(jīng)典的7次跨膜螺旋結(jié)構(gòu)，被稱中樞型大麻素受體。CB1的激活可以降低神經(jīng)遞質(zhì)的釋放，如多巴胺和GABA，從而調(diào)節(jié)人體的新陳代謝、食欲、疼痛、記憶和學(xué)習(xí)、神經(jīng)系統(tǒng)和心血管系統(tǒng)等諸多方面。因此，CB1受體是疼痛、肥胖、藥物成癮和神經(jīng)退行性等疾病的直接藥物靶標(biāo)。目前針對(duì)該受體的上市藥物主要來(lái)自于植物大麻的天然提取物。相對(duì)于天然產(chǎn)物，目前化學(xué)合成類的CB1靶向藥物副作用較大，高效低毒的藥物發(fā)展較慢，主要原因是CB1受體介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)非常復(fù)雜，人們尚未完全闡明其調(diào)控機(jī)制，因而限制了創(chuàng)新藥物的研發(fā)。

此前的研究表明CB1具有高度保守的正位結(jié)合口袋，為結(jié)構(gòu)導(dǎo)向的藥物設(shè)計(jì)帶來(lái)了一些困擾，導(dǎo)致傳統(tǒng)藥物具有較低的選擇性和特異性，副作用較高。有趣的是，CB1 受體也被發(fā)現(xiàn)存在別構(gòu)調(diào)節(jié)位點(diǎn)，且與激動(dòng)劑配體協(xié)同效應(yīng)，更好地調(diào)控信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，也表現(xiàn)出疾病治療的潛力。相比于保守的正位結(jié)合位點(diǎn)，GPCR的別構(gòu)調(diào)節(jié)位點(diǎn)具有一定的優(yōu)勢(shì)：1.亞型的選擇性和特異性；2. 與正位配體協(xié)同作用調(diào)節(jié)GPCR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，因此更適合靶向設(shè)計(jì)和發(fā)展藥物。

近期，邵振華研究員與合作者通過(guò)解析CB1受體與負(fù)向別構(gòu)調(diào)節(jié)劑的三維結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)了CB1受體中新的負(fù)向別構(gòu)調(diào)節(jié)劑識(shí)別位點(diǎn)，這與之前發(fā)現(xiàn)的GPCR別構(gòu)調(diào)節(jié)位點(diǎn)不同。GPCR家族別構(gòu)調(diào)節(jié)位點(diǎn)的多變性和非保守性的特點(diǎn)，為設(shè)計(jì)高選擇性的潛在藥物提供了新的策略，尤其在受體多種亞型間。該論文一方面有助于我們更系統(tǒng)地了解CB1受體的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制；更重要的是，別構(gòu)調(diào)節(jié)劑與激動(dòng)劑的協(xié)同效應(yīng)為CB1受體的藥物開(kāi)發(fā)也提供了新的思路，應(yīng)用前景廣泛。

大麻素受體是我們一直研究的對(duì)象，我們?cè)?016年解析了大麻素受體CB1與拮抗劑藥物的晶體結(jié)構(gòu)（Shao Z., et al Nature. 2016），該研究進(jìn)一步拓展了科學(xué)界對(duì)CB1受體的認(rèn)識(shí)。投稿過(guò)程比較順利，在初期，我們是以letter的形式投稿和送審，后來(lái)得到了雜志編輯和審稿人的高度評(píng)價(jià)，編輯要求終稿以研究長(zhǎng)文（Articles）的形式發(fā)表，此外，編輯把該論文故事作為雜志封面（cover image）的候選，但沒(méi)有入選。帶著這點(diǎn)小遺憾，同時(shí)作為勉勵(lì)，我們課題組將繼續(xù)探索大麻素等受體的作用機(jī)理和藥物開(kāi)發(fā)。

本文編輯：汪文靜

本文排版：陳紅梅　張洪雪