目的 目前組織工程骨（tissue engineered bone，TEB）缺乏有效可行的儲(chǔ)存、運(yùn)輸方法。評(píng)估TEB 經(jīng)過(guò)凍干處理后其成骨活性變化及其異位成骨能力，探索新的TEB 儲(chǔ)存和運(yùn)輸策略。 方法 取志愿者捐獻(xiàn)的骨髓和骨組織分別培養(yǎng)hBMSCs 和制備脫鈣骨基質(zhì)（decalcified bone matrix，DBM），取第3 代hBMSCs 與DBM 復(fù)合構(gòu)建TEB，分別于體外孵育3、5、7、9、12、15 d 經(jīng)過(guò)低溫干燥后得到凍干組織工程骨（freeze-dried tissue engineered bone，F(xiàn)TEB），并將體外培養(yǎng)不同時(shí)間點(diǎn)的TEB 和FTEB 行掃描電鏡觀察。Western blot 法檢測(cè)TEB 和FTEB 內(nèi)成骨相關(guān)蛋白BMP-2、TGF-β1、IGF-1 的變化。將FTEB、TEB 和DBM 分別移植于30 只6 周齡BALB/C 裸鼠皮下進(jìn)行異位成骨實(shí)驗(yàn)（n=10），并行X 線(xiàn)片評(píng)分、CT 值檢測(cè)以及HE 染色觀察。 結(jié)果 掃描電鏡觀察示，TEB 中種子細(xì)胞保持正常形態(tài)，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)分泌細(xì)胞外基質(zhì)逐漸增加；FTEB 內(nèi)的種子細(xì)胞脫水皺縮而亡，細(xì)胞外基質(zhì)位于疏松的DBM 支架材料中。Westernblot 檢測(cè)示，TEB 和FTEB 內(nèi)BMP-2、TGF-β1 和IGF-1 表達(dá)均為陽(yáng)性，除體外培養(yǎng)15 d TEB 和FTEB 的TGF-β1 蛋白積分吸光度（IA）比值比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P lt; 0.05）外，其余各時(shí)間點(diǎn)各蛋白含量比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P gt; 0.05）。移植術(shù)后4 周各種移植物未見(jiàn)明顯鈣化；術(shù)后8、12 周，TEB 和FTEB 移植裸鼠皮下可以實(shí)現(xiàn)較好的異位成骨。通過(guò)X線(xiàn)片評(píng)分、CT 值比較移植物鈣化程度，TEB 和FTEB 差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P gt; 0.05），而DBM 未見(jiàn)明顯鈣化。HE 染色示TEB 和FTEB 出現(xiàn)鈣化，DBM 降解吸收。 結(jié)論 FTEB 與TEB 具有相似的成骨活性，為T(mén)EB 的儲(chǔ)存和運(yùn)輸提供了一種新的策略和方法。
目的 結(jié)合熒光蛋白標(biāo)記技術(shù)和激光共聚焦顯微鏡三維重建技術(shù)觀察體外構(gòu)建的組織工程骨及其體內(nèi)移植情況，為篩選優(yōu)良的支架材料和三維構(gòu)建方法提供技術(shù)支持。 方法 取2 歲齡青山羊（體重約25 kg）髂骨骨髓，利用密度梯度離心法結(jié)合貼壁培養(yǎng)法分離培養(yǎng)BMSCs，并通過(guò)流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)表面分子CD29、CD60L、CD45和CD44 表達(dá)情況。將質(zhì)粒pLEGFP-N1 擴(kuò)增、提取后酶切鑒定。用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的方法將質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到PT67 包裝細(xì)胞，G418 篩選后擴(kuò)增，獲取病毒液。根據(jù)測(cè)定的滴度轉(zhuǎn)染BMSCs，獲得綠色熒光蛋白（green fluorescent protein，GFP）表達(dá)的BMSCs，擴(kuò)增后作為種子細(xì)胞，以脫鈣骨基質(zhì)作為支架材料構(gòu)建組織工程骨，并利用激光共聚焦顯微鏡觀察種子細(xì)胞。將構(gòu)建的組織工程骨移植到山羊股骨缺損處，利用激光共聚焦顯微鏡觀察其存活和分布情況。 結(jié)果 獲得的細(xì)胞呈成纖維細(xì)胞狀，CD29 和CD44 呈陽(yáng)性表達(dá)，CD60L 和CD45 呈陰性。質(zhì)粒pLEGFP-N1 用Hind Ⅲ、BamH Ⅰ、Sal Ⅰ和Bgl Ⅱ內(nèi)切酶酶切后，凝膠電泳可見(jiàn)其相對(duì)分子質(zhì)量約6 900 bp。將pLEGFP-N1 轉(zhuǎn)染到PT67 包裝細(xì)胞擴(kuò)增后獲取病毒液。根據(jù)測(cè)定的滴度（1.3 × 106 cfu/mL）轉(zhuǎn)染BMSCs，獲得GFP 表達(dá)陽(yáng)性的BMSCs 克隆。激光共聚焦顯微鏡三維立體成像技術(shù)觀察到BMSCs 在組織工程骨支架上分布、增殖和遷移。將構(gòu)建的組織工程骨移植到山羊股骨缺損處，28 d 后激光共聚焦顯微鏡觀察到GFP 陽(yáng)性細(xì)胞在移植區(qū)仍存在。 結(jié)論 熒光蛋白標(biāo)記技術(shù)結(jié)合激光共聚焦顯微鏡三維重建技術(shù)可很好地觀察支架上和移植體內(nèi)的細(xì)胞，為組織工程產(chǎn)物三維培養(yǎng)的立體觀察提供了可行方法。