目的構(gòu)建人膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（human glial cell derived neurotrophic factor，hGDNF）基因修飾的猴雪旺細(xì)胞穩(wěn)定細(xì)胞系。 方法以pUC19-hGDNF為模板，擴(kuò)增含hGDNF基因序列，將其插入質(zhì)粒pBABE-puro，構(gòu)建pBABE-puro-hGDNF重組真核表達(dá)載體，經(jīng)酶切鑒定及DNA測序鑒定重組質(zhì)粒。從恒河猴提取、培養(yǎng)、純化雪旺細(xì)胞。包裝病毒，利用含hGDNF基因的重組逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)染雪旺細(xì)胞，實(shí)時(shí)熒光定量PCR、Western blot檢測hGDNF mRNA及蛋白表達(dá)情況。 結(jié)果PCR產(chǎn)物hGDNF基因編碼序列大小約596 bp。重組表達(dá)載體經(jīng)雙酶切鑒定，含有1 條596 bp的特異性條帶，其基因測序結(jié)果與基因庫中hGDNF基因序列片段相同，提示hGDNF基因成功轉(zhuǎn)入逆轉(zhuǎn)錄病毒。逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)染的雪旺細(xì)胞hGDNF mRNA及蛋白表達(dá)量顯著高于未轉(zhuǎn)染雪旺細(xì)胞，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P lt; 0.05）。 結(jié)論成功構(gòu)建hGDNF基因修飾的猴雪旺細(xì)胞穩(wěn)定細(xì)胞系，能長期穩(wěn)定高效釋放hGDNF，為進(jìn)一步將其應(yīng)用于神經(jīng)損傷修復(fù)奠定了基礎(chǔ)。
目的研究恒河猴BMSCs在缺氧再給氧環(huán)境下對新生豬胰島活性和功能的保護(hù)作用。 方法取健康成年恒河猴5只，體重6～10 kg，取骨髓采用骨髓單核細(xì)胞貼壁培養(yǎng)法篩選獲得BMSCs；取3～5日齡新生長白豬5 只，取胰腺以Ⅴ型膠原酶消化制備新生豬胰島。將實(shí)驗(yàn)分為胰島正常組（A組）、胰島加BMSCs正常組（B組）、胰島缺氧再給氧組（C組）、胰島加BMSCs缺氧再給氧組（D組），觀察比較常規(guī)培養(yǎng)和缺氧（1%O2）12 h再給氧24 h或48 h條件下，胰島的功能活性變化：二乙酸熒光素/碘化丙啶（propidium iodide，PI）染色計(jì)算胰島成活率；細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒8法檢測新生豬胰島的代謝活性；膜聯(lián)蛋白V-FITC/PI標(biāo)記后流式細(xì)胞儀檢測胰島凋亡率；葡萄糖刺激法分析胰島功能糖刺激指數(shù)（stimulation index，SI）。 結(jié)果C組較A、B組胰島團(tuán)更為分散，死亡細(xì)胞增多；D組較C組胰島團(tuán)完整，成活率更高。A、B、C、D組胰島成活率分別為90.2% ± 9.1%、88.3% ± 5.9%、52.3% ± 12.1%、71.4% ± 11.5%，C、D組顯著低于A、B組（P lt; 0.05），D組顯著高于C組（P lt; 0.05）。D組BMSCs以1∶10和1∶20比例與胰島缺氧再給氧共培養(yǎng)后，代謝活性顯著高于C組（P lt; 0.05）。A、B、C、D組胰島凋亡率分別為27.1% ± 3.2%、24.0% ± 1.0%、64.3% ± 1.8%、46.2% ± 1.4%，C、D組顯著高于A、B組（P lt; 0.05），但D組顯著低于C組（P lt; 0.05）。各時(shí)間點(diǎn)A、B組SI比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P gt; 0.05），C組顯著低于A、B組（P lt; 0.05），在24 h和72 h時(shí)D組顯著高于C組（P lt; 0.05）。 結(jié)論BMSCs對缺氧再給氧誘導(dǎo)的新生豬胰島活性和功能損傷具有保護(hù)作用。
目的 建立恒河猴外周血CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞（regulatory T cells，Tregs）快速有效的分離純化方法。 方法4～5歲健康恒河猴10只，雌性4只，雄性6只，體重5～8 kg；于大隱靜脈抽取外周血，每只抽取8 mL。密度梯度離心法分離外周血單個(gè)核細(xì)胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC），分別采用非人靈長類Tregs分離試劑盒的生物素標(biāo)記的混合抗體和磁珠標(biāo)記的抗生物素抗體陰性分選，以及大鼠抗人CD4-活化蛋白C（activated protein C，APC）和抗APC多選試劑盒中的磁珠標(biāo)記的抗APC抗體陽性分選出 CD4+ T淋巴細(xì)胞，比較兩種方法獲得細(xì)胞的得率、活性及純度；選擇得率、活性和純度較高的分選方法獲得的CD4+ T淋巴細(xì)胞，用磁珠標(biāo)記的抗人CD25抗體進(jìn)行陽性分選，獲得 CD4+CD25+ Tregs，流式細(xì)胞儀檢測純度、活性及FoxP3表達(dá)水平，以及Tregs對刀豆蛋白（concanavalin A，ConA）刺激的自體CD4+CD25-效應(yīng)性T淋巴細(xì)胞（effective T cells，Teffs）增殖的抑制功能。 結(jié)果CD4+ T淋巴細(xì)胞陽性分選和陰性分選后，細(xì)胞活性均達(dá)95%左右，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P gt; 0.05），但陽性分選后CD4+ T淋巴細(xì)胞得率和純度均顯著高于陰性分選（P lt; 0.05）。后續(xù)CD4+CD25+ Tregs分選采用陽性分選法獲得的CD4+ T淋巴細(xì)胞。經(jīng)雙陽性分選收集的目的細(xì)胞中CD4+CD25+ Tregs占76.2% ± 8.6%，活細(xì)胞比例為93.3% ± 4.7%，F(xiàn)oxP3陽性細(xì)胞比例為74.2% ± 6.9%?；旌吓囵B(yǎng)后Tregs均對ConA刺激的Teffs的增殖有抑制作用。 結(jié)論免疫磁珠雙陽性分選法能有效分選出恒河猴外周血中有功能的CD4+CD25+ Tregs。
目的 建立長白小家豬到恒河猴異位輔助性肝移植模型，總結(jié)手術(shù)操作要點(diǎn)。方法 以健康雄性長白小家豬和健康恒河猴各5只建立豬到猴異位輔助性肝移植模型。以長白小家豬作為肝移植供體，以恒河猴作為受體。保留長白小家豬的右后葉和部分右前葉作為供肝，移植到受體的左腎窩和左結(jié)腸旁溝處。短暫阻斷受體的腹主動(dòng)脈和下腔靜脈血流后，將移植肝的門靜脈和肝下下腔靜脈分別與受體的腹主動(dòng)脈和下腔靜脈行端側(cè)吻合。結(jié)扎移植肝的肝動(dòng)脈，不予重建。術(shù)后觀察受體的一般情況和生存時(shí)間。結(jié)果 成功建立4對肝移植模型，供肝切取時(shí)間24～35min、（30±5） min，供肝修整時(shí)間31～51min、（40±10） min，受體下腔靜脈阻斷時(shí)間23～36min、（30±6） min，受體腹主動(dòng)脈阻斷時(shí)間22～38min、（30±8） min，肝移植手術(shù)時(shí)間130～310min、（220±80） min，術(shù)中失血35～48mL、（42±6） mL。術(shù)后均無吻合口血栓形成及膽漏發(fā)生。4只受體分別于術(shù)后48、54、88及96h死亡，死亡原因均為排斥反應(yīng)及術(shù)中失血過多。結(jié)論 豬到猴異位輔助性肝移植模型的可重復(fù)性強(qiáng)、手術(shù)易操作、移植器官灌注良好，可用于豬到非人類靈長類動(dòng)物肝移植的進(jìn)一步研究。
目的 探討恒河猴原位肝移植模型建立的最佳方案。方法 選用10對健康恒河猴進(jìn)行同種異體肝移植，借鑒各種動(dòng)物模型建立的方法，使用門靜脈袖套法建立穩(wěn)定的恒河猴原位肝移植模型。結(jié)果 10只恒河猴原位肝移植模型手術(shù)均成功。供體切取手術(shù)時(shí)間(20±5) min，供肝修整時(shí)間(30±7) min； 受體手術(shù)時(shí)間(180±35) min,受體無肝期(17±4) min。術(shù)后24 h存活者9只,1只術(shù)后9 h死于腹腔內(nèi)出血; 72 h存活者8只，于術(shù)后38 h因消化道出血再死亡1只; 1周存活5只,3只分別于術(shù)后9、11和11 d死于排斥反應(yīng)； 最長存活32 d者也死于排斥反應(yīng)。所有受體均無門靜脈血栓形成及膽道并發(fā)癥發(fā)生。結(jié)論 改進(jìn)后的恒河猴同種異體原位肝移植模型具有操作簡便、手術(shù)成功率高的優(yōu)點(diǎn), 是肝移植臨床前期研究較理想的動(dòng)物模型。
人淋巴細(xì)胞功能相關(guān)抗原3(hLFA3)是一種重要的T細(xì)胞黏附分子, 其與CD2結(jié)合后可促進(jìn)T細(xì)胞活化。恒河猴被廣泛用作人類免疫疾病動(dòng)物模型。因免疫系統(tǒng)存在嚴(yán)格的種屬特異性, 有必要研究恒河猴L(fēng)FA3的功能。本文通過PCR擴(kuò)增獲得mmLFA3Sh基因, 將其與人IgG1 Fc片段融合, 插入畢赤酵母表達(dá)載體構(gòu)建表達(dá)質(zhì)粒pPIC9K-mmLFA3Sh-Ig。誘導(dǎo)表達(dá)后獲得融合蛋白mmLFA3Sh-Ig, 產(chǎn)量為3~4 mg/L。mmLFA3Sh-Ig能夠特異性與CD2陽性細(xì)胞結(jié)合, 能夠抑制Con A和同種抗原刺激的猴和人淋巴細(xì)胞增殖。這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明, mmLFA3Sh-Ig可能作為一種新的生物制劑用于研究恒河猴免疫疾病發(fā)病機(jī)制和實(shí)驗(yàn)治療。
目的檢測轉(zhuǎn)化生長因子（TGF）-β1在恒河猴肝移植術(shù)后急性排斥反應(yīng)時(shí)肝組織中的表達(dá)水平，以評價(jià)其作為肝移植術(shù)后急性排斥反應(yīng)早期診斷指標(biāo)的價(jià)值。 方法采用改良血管袖套＋膽道支撐管＋動(dòng)脈吻合法建立穩(wěn)定的恒河猴肝移植模型，將其隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組（圍手術(shù)期不給予免疫抑制治療）和對照組（圍手術(shù)期給予免疫抑制治療）。繼而分別在肝移植術(shù)后6 h、12 h、24 h和72 h四個(gè)時(shí)間點(diǎn)分別收集血清及肝組織，通過肝功能指標(biāo)檢測及移植肝組織蘇木精-伊紅染色Banff評分評價(jià)其移植排斥反應(yīng)情況，并應(yīng)用免疫組織化學(xué)、Western blot法分別檢測TGF-β1蛋白表達(dá)情況。 結(jié)果①2組恒河猴肝移植術(shù)后12 h、24 h和72 h均有急性排斥反應(yīng)發(fā)生，尤其肝移植后72 h時(shí)實(shí)驗(yàn)組肝組織急性排斥反應(yīng)重于對照組，Banff分級水平高于對照組（P＜0.05）。②2組術(shù)后ALT、AST和TBIL水平均隨著時(shí)間的延長呈上升趨勢（P＜0.05），在移植術(shù)后6 h和12 h時(shí)2組ALT、AST和TBIL水平比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；在移植術(shù)后24 h和72 h時(shí)實(shí)驗(yàn)組ALT、AST和TBIL水平均明顯高于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。③免疫組織化學(xué)檢測TGF-β1蛋白表達(dá)結(jié)果：實(shí)驗(yàn)組肝移植術(shù)后12 h后肝組織中TGF-β1免疫組織化學(xué)染色陽性面積百分率隨著時(shí)間延長不斷升高，且均明顯高于對照組相應(yīng)時(shí)相（P＜0.05）。④Western blot檢測TGF-β1蛋白表達(dá)的半定量結(jié)果：實(shí)驗(yàn)組和對照組均在6 h即開始隨著時(shí)間的延長呈現(xiàn)上調(diào)趨勢，而實(shí)驗(yàn)組上調(diào)的幅度較對照組大，在6 h、12 h、24 h和72 h時(shí)實(shí)驗(yàn)組均分別明顯高于對照組相應(yīng)時(shí)相，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P值分別是0.003、0.001、0.001、0.001）。 結(jié)論肝移植術(shù)后肝組織中TGF-β1水平升高提示機(jī)體細(xì)胞免疫功能增強(qiáng)，對肝移植術(shù)后急性排斥反應(yīng)的早期診斷可能有一定意義。
目的應(yīng)用T1ρ-MRI技術(shù)評估雌性恒河猴腰椎骨密度與椎間盤退變的相關(guān)關(guān)系。 方法選取20只雌性恒河猴，年齡4～20歲，平均10.9歲；體重5.3～10.8 kg，平均7.4 kg。采用Osteocore雙能X線骨密度儀測定L4、5及雙髖ward三角區(qū)骨密度值。采用1.5 Tesla 磁共振儀對L4、5椎間盤進(jìn)行Pfirrmann分級并測定其T1ρ弛豫時(shí)間（T1ρ值）。分析T1ρ值及Pfirrmann分級與年齡、體重及腰椎、髖骨ward三角區(qū)骨密度值的相關(guān)關(guān)系。 結(jié)果腰椎骨密度值為（0.64±0.17）g/cm2，髖骨ward三角區(qū)為（0.67±0.19）g/cm2，比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=2.893，P=0.128）。L4、5椎間盤按Pfirrmann分級標(biāo)準(zhǔn)：Ⅰ級7例，Ⅱ級8例，Ⅲ級5例。腰椎間盤T1ρ值為（104.08±18.65）ms，Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ級分別為（121.31±13.44）、（104.73±15.01）、（77.41±11.87）ms。腰椎間盤 T1ρ值與年齡、腰椎及髖骨ward三角區(qū)骨密度值均成負(fù)相關(guān)，L4、5椎間盤Pfirrmann分級與以上指標(biāo)均成正相關(guān)；L4、5椎間盤Pfirrmann分級與腰椎間盤T1ρ值成負(fù)相關(guān)。 結(jié)論腰椎間盤T1ρ值可作為椎間盤退變的量化評價(jià)指標(biāo)，雌性恒河猴腰椎骨密度與腰椎間盤退變成正相關(guān)關(guān)系。
目的建立恒河猴腰椎間盤缺血性退變模型并通過T1ρ自旋鎖定成像和T2-mapping技術(shù)驗(yàn)證其可靠性。 方法選取12只健康雌性恒河猴，年齡4～6歲，體重4.4～6.1 kg。每只設(shè)L5、6椎間盤作為實(shí)驗(yàn)組，L4、5椎間盤作為對照組。實(shí)驗(yàn)組于椎間盤相鄰的上、下軟骨終板下骨各緩慢注射平陽霉素（2 mg/mL）1 mL，對照組各注射生理鹽水1 mL。于術(shù)前及術(shù)后1、4、12周采用MRI T1ρ和T2-mapping技術(shù)量化評估退變進(jìn)程，術(shù)后4、12周取材行HE染色觀察。 結(jié)果對照組手術(shù)前后各時(shí)間點(diǎn)T1ρ、T2 map弛豫時(shí)間值均無明顯變化，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。實(shí)驗(yàn)組T1ρ弛豫時(shí)間值于術(shù)后4周明顯下降，4、12周與術(shù)前及術(shù)后1周比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；T2 map弛豫時(shí)間值于術(shù)后12周明顯下降，與其余時(shí)間點(diǎn)比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。對照組與實(shí)驗(yàn)組間除術(shù)后4、12周T1ρ弛豫時(shí)間值及術(shù)后12周T2 map弛豫時(shí)間值比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）外，其余時(shí)間點(diǎn)兩組間比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。對照組及實(shí)驗(yàn)組手術(shù)前后各時(shí)間點(diǎn)間比較以及各時(shí)間點(diǎn)兩組間比較T2WI 軸位髓核高信號區(qū)面積占整個(gè)椎間盤面積百分比，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。組織學(xué)觀察示，對照組各時(shí)間點(diǎn)椎間盤髓核及纖維環(huán)結(jié)構(gòu)未見異常。實(shí)驗(yàn)組術(shù)后4周椎間盤髓核細(xì)胞數(shù)目減少、排列不規(guī)則；12周椎間盤髓核纖維化，內(nèi)層纖維環(huán)出現(xiàn)裂隙改變。 結(jié)論經(jīng)椎體終板下骨注射平陽霉素可獲得可靠的恒河猴腰椎間盤缺血性退變模型，T1ρ自旋鎖定成像和T2-mapping可作為椎間盤早期退變的量化評價(jià)指標(biāo)
目的研究恒河猴坐骨神經(jīng)損傷修復(fù)后脛神經(jīng)和腓總神經(jīng)髓鞘變性與再生的變化規(guī)律及其軸突密度差異情況。 方法取健康成年恒河猴9只，雌雄不限，體質(zhì)量3.5～4.5 kg，通過銳性切割造成脛神經(jīng)和腓總神經(jīng)離斷損傷模型。術(shù)中取3只動(dòng)物，于損傷平面以遠(yuǎn)5 mm處切取長5 mm的脛神經(jīng)及腓總神經(jīng)作為正常對照；余6只采用神經(jīng)外膜縫合法修復(fù)后，于術(shù)后3、8周各取3只行大體觀察、神經(jīng)電生理檢測，并切取脛神經(jīng)和腓總神經(jīng)吻合口遠(yuǎn)端神經(jīng)組織行Luxol Fast Blue染色，觀察脛神經(jīng)和腓總神經(jīng)髓鞘變化情況，計(jì)算脛神經(jīng)和腓總神經(jīng)軸突密度和軸突再生率。 結(jié)果術(shù)后實(shí)驗(yàn)動(dòng)物均出現(xiàn)下肢肌肉萎縮及足趾不同程度潰瘍。大體觀察見吻合部神經(jīng)膨大，周圍結(jié)締組織增生，粘連明顯。術(shù)后3周未檢測到脛神經(jīng)及腓總神經(jīng)復(fù)合肌肉動(dòng)作電位（compound muscle actionpotential，CMAP），8周腓總神經(jīng)CMAP波幅小于脛神經(jīng)。組織學(xué)觀察示，術(shù)后3周脛神經(jīng)和腓總神經(jīng)軸突均發(fā)生不同程度變性，以腓總神經(jīng)變性明顯，腓總神經(jīng)軸突再生率為13.2%，顯著低于脛神經(jīng)的44.5%；術(shù)后8周脛神經(jīng)和腓總神經(jīng)均可見再生軸突，腓總神經(jīng)軸突再生率為10.3%，仍顯著低于脛神經(jīng)的35.3%。 結(jié)論與腓總神經(jīng)相比，脛神經(jīng)損傷修復(fù)后軸突退變速度慢、再生速度快，軸突再生比例高，其靶器官有更多神經(jīng)纖維支配，靶肌肉CAMP恢復(fù)快、幅度高，脛神經(jīng)功能恢復(fù)更好。