目的 觀察肝細(xì)胞生長因子（hepatocyte growth factor，HGF）修飾的BMSCs 對大鼠同種異體肝移植后免疫排斥反應(yīng)的影響，探討其誘導(dǎo)免疫耐受的機(jī)制。 方法 3 ～ 4 周齡清潔級雄性SD 大鼠8 只，體重75 ～ 85 g，用于分離培養(yǎng)BMSCs；成年清潔級雄性SD 大鼠64 只，體重200 ～ 250 g，作為供體；成年清潔級雄性Wistar 大鼠64 只，體重230 ～ 280 g，作為受體。建立穩(wěn)定的同種異體肝移植動物模型并隨機(jī)分為4 組（n=16），A、B、C、D 組分別立即經(jīng)門靜脈注入1 mL 生理鹽水、1 mL 細(xì)胞密度為2 × 106 個/mL 的BMSCs、1 mL 細(xì)胞密度為2 × 106 個/mL 的BMSCs/ 綠色熒光蛋白、1 mL 細(xì)胞密度為2 × 106 個/mL 的BMSCs/hHGF。術(shù)后作實驗動物生存曲線分析；術(shù)后7 d 檢測實驗動物肝功能，并取肝臟組織行病理組織學(xué)觀察，RT-PCR 檢測肝組織內(nèi)hHGF mRNA 表達(dá)，ELISA 法檢測血清中hHGF、IL-2、IL-4、IL-10、IFN-γ 細(xì)胞因子的表達(dá)，TUNEL 法檢測肝組織內(nèi)細(xì)胞凋亡情況，免疫組織化學(xué)方法檢測增殖細(xì)胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）在肝組織內(nèi)的表達(dá)。 結(jié)果 D 組生存時間顯著高于A、B、C 組（P lt; 0.01）；B、C 組生存時間明顯高于A 組（P lt; 0.01），但B、C 組間生存時間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P gt; 0.05）。RT-PCR 示檢測D 組肝組織內(nèi)有hHGF mRNA 表達(dá)，ELISA 檢測血清中hHGF 水平達(dá)（6.2 ± 1.0）ng/mL。相比B、C 組，D 組療效更顯著，肝功能明顯改善，病理學(xué)無急性排斥反應(yīng)或僅為輕度；IL-2、IFN-γ 水平降低，IL-4、IL-10 水平升高，細(xì)胞凋亡明顯減少，PCNA 表達(dá)顯著升高，除IL-4 水平比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P gt; 0.05）外，其余指標(biāo)比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P lt; 0.05）。 結(jié)論 通過門靜脈輸注BMSCs/hHGF 至大鼠同種異體肝移植模型能成功誘導(dǎo)免疫耐受。與單純應(yīng)用BMSCs 相比，BMSCs/hHGF在移植肝局部形成高濃度hHGF 免疫抑制微環(huán)境，能更顯著抑制急性排斥反應(yīng)，延長移植受體存活時間。BMSCs/hHGF的免疫抑制作用與誘導(dǎo)Th1 細(xì)胞向Th2 細(xì)胞偏移、減少肝細(xì)胞凋亡、促進(jìn)肝細(xì)胞增殖有關(guān)。
目的 構(gòu)建攜帶人肝細(xì)胞生長因子（human hepatocyte growth factor，hHGF）基因的慢病毒，感染大鼠BMSCs，建立穩(wěn)定表達(dá)hHGF 的BMSCs/hHGF 細(xì)胞。 方法 從含hHGF 基因的質(zhì)粒pcDNA-hHGF 中，用PCR 法獲取hHGF 全長基因，與慢病毒載體pGC-E1 分別進(jìn)行Age Ⅰ酶切，產(chǎn)物定向連接，轉(zhuǎn)化后行PCR 鑒定和測序，構(gòu)建hHGF 慢病毒表達(dá)質(zhì)粒。脂質(zhì)體Lipofectamine 2000 介導(dǎo)慢病毒載體三質(zhì)粒pGC-E1-hHGF、pHelper 1.0、pHelper 2.0 共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞。收集病毒超濾離心濃縮，實時定量PCR 測定滴度。將hHGF 慢病毒感染BMSCs，熒光顯微鏡觀察熒光表達(dá)，確定最佳感染復(fù)數(shù)（multiplicities of infection，MOI）值，以最佳MOI 值感染細(xì)胞，流式細(xì)胞儀檢測感染效率，ELISA 法檢測細(xì)胞培養(yǎng)上清hHGF 分泌水平，RT-PCR 檢測hHGF 基因的表達(dá)。 結(jié)果 實驗成功構(gòu)建攜帶hHGF 基因的慢病毒，滴度達(dá)1 × 108 TU/mL。hHGF 慢病毒高效率感染BMSCs，最佳MOI 值為10。流式細(xì)胞儀檢測感染效率達(dá)98%，且在感染后28 d BMSCs 仍穩(wěn)定表達(dá)強烈的綠色熒光。細(xì)胞培養(yǎng)上清可檢測到hHGF 因子，術(shù)后5 d 達(dá)高峰，達(dá)40.5 ng/mL，這種高水平分泌可持續(xù)至感染后28 d。RT-PCR 檢測出hHGF 基因的表達(dá)。 結(jié)論 通過慢病毒載體將hHGF 基因穩(wěn)定感染至BMSCs 細(xì)胞，可獲得長期穩(wěn)定的表達(dá)，并持續(xù)分泌hHGF 因子。
目的 探討建立穩(wěn)定大鼠原位肝移植模型的手術(shù)操作技巧。 方法 成年雄性SD 大鼠200 只，體重200 ～ 250 g；成年雄性Wistar 大鼠60 只，體重230 ～ 280 g，供體體重小于受體約30 g。其中SD 大鼠為供、受體的同基因肝移植70 只（SD-SD 組），SD、Wistar 分別為供、受體的同種異體肝移植60 只（SD-Wistar 組）。采用改良二袖套法行大鼠原位肝移植，充分暴露第一肝門，不翻動肝臟先行門靜脈灌注；在體一步法離斷肝上下腔靜脈，不帶膈肌環(huán)；吻合肝上下腔靜脈采用單線連續(xù)縫合；雙線牽引法安裝門靜脈袖套。術(shù)后充分補液維持大鼠血液動力學(xué)穩(wěn)定。 結(jié)果 供體手術(shù)時間（38.2 ± 2.5）min，受體手術(shù)時間（45.6 ± 3.5）min，無肝期（15.1 ± 2.2）min，手術(shù)成功率93%，1 周存活率92%，與傳統(tǒng)二袖套法比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P lt; 0.05）。SD-SD 組手術(shù)成功64 只，受體存活時間2 ～ 9 個月，平均145 d；術(shù)后約3 d 肝功能恢復(fù)正常，肝組織病理無明顯變化。SD-Wistar 組手術(shù)成功57 只，受體存活時間8 ～ 20 d，平均10.5 d；大鼠于術(shù)后3 ～ 5 d 出現(xiàn)急性排斥反應(yīng)，未經(jīng)處理后均死亡。 結(jié)論 改良式肝移植操作簡便，成功率高，可為大鼠原位肝移植實驗提供穩(wěn)定可靠的動物模型。