目的 構(gòu)建豬TGF-β1 重組慢病毒表達(dá)載體，并轉(zhuǎn)染BMSCs，為構(gòu)建組織工程骨軟骨提供TGF-β1 修飾的BMSCs，作為持續(xù)、高效的種子細(xì)胞。 方法 將已獲取的目的基因TGF-β1 cDNA 包裝至慢病毒載體中，通過PCR及基因測序?qū)﹃栃钥寺∵M(jìn)行鑒定，并測定病毒滴度。取2 月齡巴馬香豬（體重約15 kg）骨髓制備BMSCs，取第2 ～ 3代用于實驗。用TGF-β1 重組慢病毒載體以感染復(fù)數(shù)（multiplicity of infection， MOI）為10、50、70、100、150 分別轉(zhuǎn)染BMSCs，通過激光共聚焦顯微鏡觀察，并以Western blot 檢測不同MOI 值的轉(zhuǎn)染效果，確定最佳MOI 值。用TGF-β1 重組慢病毒載體以最佳MOI 值感染BMSCs 作為實驗組，以空載體轉(zhuǎn)染的BMSCs（空載體組）及未轉(zhuǎn)染的BMSCs（空白組）作為對照，通過RT-PCR、免疫細(xì)胞化學(xué)染色、ELISA 等方法檢測TGF-β1 基因及蛋白在BMSCs 中的表達(dá)情況，并檢測Ⅱ型膠原表達(dá)情況。 結(jié)果 經(jīng)PCR 及基因測序鑒定TGF-β1 重組慢病毒表達(dá)載體構(gòu)建成功，并成功轉(zhuǎn)染BMSCs，激光共聚焦顯微鏡下可觀察到強(qiáng)綠色熒光；Western blot 示MOI 為70 時轉(zhuǎn)染效果最佳；RT-PCR 示實驗組TGF-β1 基因的表達(dá)量明顯高于空載體組及空白組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P lt; 0.05）；免疫細(xì)胞化學(xué)染色示實驗組TGF-β1 蛋白及Ⅱ型膠原呈陽性表達(dá)，而空載體組及空白組呈弱陽性或陰性表達(dá)；ELISA 示實驗組TGF-β1 蛋白至轉(zhuǎn)染后21 d 仍有較高表達(dá)。 結(jié)論 TGF-β1 重組慢病毒表達(dá)載體可成功轉(zhuǎn)染BMSCs，TGF-β1 蛋白可長期、穩(wěn)定表達(dá)，促使BMSCs 向成軟骨細(xì)胞方向分化。
目的制備膠原-殼聚糖/膠原-納米羥基磷灰石（collagen-chitosan/nano-hydroxyapatite-collagen-polylactic acid，Col-CS/nHAC-PLA）仿生支架材料，檢測生物相容性，為其在骨軟骨缺損修復(fù)中的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。 方 法以1，4二氧六環(huán)為溶劑，按8%質(zhì)量濃度加入PLA和等量nHAC溶解，制備nHAC-PLA；用2%醋酸溶液配制濃度為2%的CS純?nèi)芤杭?%的Col純?nèi)芤?，以質(zhì)量比（M/M）20∶1混合，倒入含nHAC-PLA的模具中，冷凍干燥成形制備Col-CS/nHAC-PLA仿生支架。行急性全身毒性實驗、皮內(nèi)刺激實驗、熱源實驗、溶血實驗、體外細(xì)胞毒實驗、骨植入實驗，評價其生物相容性。 結(jié)果Col-CS/nHAC-PLA仿生支架無急性全身毒性；皮內(nèi)刺激實驗示原發(fā)刺激指數(shù)為0分，為極輕微刺激；熱原實驗示3只實驗動物體溫升高均lt; 0.6℃，體溫升高總和lt; 1.3℃，符合規(guī)定標(biāo)準(zhǔn)；溶血實驗示平均溶血率為1.38%，符合 ≤5%標(biāo)準(zhǔn)。體外細(xì)胞毒性實驗示材料浸提液不影響兔BMSCs增殖，毒性分級為Ⅰ級。骨植入實驗顯示支架材料與周邊組織相容性好。 結(jié)論Col-CS/nHAC-PLA仿生支架材料具有良好生物相容性，有望成為較理想的組織工程骨軟骨支架。