目的 設計、構建并篩選出轉染至人骨肉瘤細胞系OS-9901，對c-myc 沉默效果最佳的復制缺陷型重組腺病毒質粒pAd-c-myc- 短發(fā)夾RNA（short hairpin RNA，shRNA）包裝出表達c-myc-shRNA 的重組腺病毒，并測定其滴度。 方法 設計有shRNA 結構的3 對單鏈寡核苷酸（ss oligos），經變性退火為雙鏈寡核苷酸（ds oligos），插入穿梭質粒pENTR/U6 載體，測序正確后，經LipofectamineTM2000 陽離子脂質體介導入人骨肉瘤細胞系OS-9901，采用RTPCR篩選對c-myc 沉默效果最佳的穿梭質粒pENTR/U6-shRNA，然后與腺病毒骨架質粒行同源重組，篩選出正確重組子。采用293A 細胞包裝出表達c-myc-shRNA 的復制缺陷型重組腺病毒，觀察其細胞病變效應（cytopathic effect，CPE），采用病毒顆粒法（viral particles，VP）和50% 組織培養(yǎng)感染劑量法（50% tissue culture infective dose，TCID50）測定病毒滴度。 結 果 電泳驗證后的ds oligos 插入穿梭質粒pENTR/U6 載體，測序結果提示構建的pENTR/U6-shRNA 質粒正確。從3 對ds oligos 通過RT-PCR 方法篩選出對c-myc 沉默效果最佳的穿梭質粒pENTR/U6-shRNA，經Pac Ⅰ酶切線性化后同源重組成功構建了介導c-myc-shRNA 復制缺陷型重組腺病毒，CPE 和空泡現象 3 d 開始出現，6 d 更加明顯。采用VP法測定的第1 代腺病毒滴度為5.23 × 109 VP/mL，經3 ～ 4 代擴增后可達2.26 × 1012 VP/mL。TCID50 證實病毒滴度為10-3.8/0.1 mL。 結論 通過RNA 干擾技術，體外成功構建了介導shRNA-c-myc 復制缺陷型重組腺病毒。
檢測人腰椎間盤組織中的細胞密度、細胞凋亡率以及Bax 和半胱氨酸蛋白酶蛋白3（Caspase-3）的表達，為深入了解人腰椎間盤退變的機制提供實驗依據，并為將來通過生物學方法延緩腰椎間盤退變提供新的思路。 方法 實驗組30 個椎間盤標本（L2 ～ S1）來自27 例行后路腰椎間盤切除椎間融合手術自愿捐贈的患者，男18 例，女9 例；年齡30 ～ 72 歲，平均51.09 歲。所有病變節(jié)段均經MRI 證實，患者術前均未接受椎間盤造影、膠原酶髓核溶解或椎間盤激光汽化術。對照組20 個標本（L2 ～ S1）來自5 例青年男性意外死亡者新鮮尸檢腰椎間盤；年齡24 ～ 37 歲，平均30.83 歲。采用HE 染色觀察凋亡軟骨細胞、凋亡小體和細胞密度，TUNEL 染色法檢測人腰椎間盤中的凋亡細胞率，用SP 免疫組織化學法檢測Bax 及Caspase-3 表達，圖像分析Bax 及Caspase-3 的平均灰度值。 結果 HE 染色示對照組、實驗組軟骨終板和髓核內的平均細胞密度分別為（17.16 ± 1.22）、（12.41 ± 0.95）個/HP，二者差異有統計學意義（P lt;0.01）。TUNEL染色觀察示對照組的軟骨終板與髓核內的平均凋亡細胞率為6.97% ± 0.92%，低于實驗組的12.59% ± 0.95%（P lt; 0.01）。SP 免疫組織化學染色示對照組髓核內Bax 、Caspase-3 染色陽性細胞率分別為11.02% ± 1.18% 和9.01% ±1.00%，均低于實驗組的19.29% ± 1.18% 和15.07% ± 0.97%，差異均有統計學意義（P lt; 0.01）。對照組腰椎間盤髓核內Bax、Caspase-3 的平均灰度值分別為187.33 ± 7.88 和185.68 ± 3.26，實驗組分別為124.98 ± 6.69 和160.13 ± 4.37，兩組間比較差異有統計學意義（P lt; 0.01）。將全部腰椎間盤標本進行Pearson 相關分析，對照組和實驗組腰椎間盤凋亡細胞率與細胞密度間成負相關，相關系數r 分別為－ 0.88 和－ 0.93（P lt; 0.01）；兩組髓核內Bax、Caspase-3 陽性細胞率與凋亡細胞率之間成正相關，相關系數r 分別為 0.83 和 0.91（P lt; 0.01）。 結論 細胞密度下降參與了人腰椎間盤的退變過程，Bax和Caspase-3 的表達上調在人腰椎間盤髓核細胞的凋亡過程中有一定作用。