目的 探討低氧誘導(dǎo)因子 1α(hypoxia-inducible factor 1α,HIF-1α)基因在大鼠終板軟骨細(xì)胞中的表達(dá)情況及其與終板軟骨細(xì)胞凋亡的關(guān)系。 方法 取 8 只 10 周齡 SPF 級(jí)雄性 SD 大鼠 L1~5 腰椎終板軟骨組織,采用酶消化法分離培養(yǎng)終板軟骨細(xì)胞并傳代,取第 3 代細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。首先將終板軟骨細(xì)胞分為兩組,分別于 20% O2 常氧條件下(A 組)以及 0.5% O2 低氧下條件(B 組)培養(yǎng);培養(yǎng) 24 h,倒置相差顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài),流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率,實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 檢測(cè) HIF-1α 基因表達(dá),Western blot 檢測(cè)凋亡蛋白 HIF-1α、Bax、Bcl-2 表達(dá)。然后,構(gòu)建 LipofectaminTM2000 載體試劑和 HIF-1α siRNA/ LipofectaminTM2000 載體混合劑分別轉(zhuǎn)染終板軟骨細(xì)胞后,于 0.5% O2 低氧條件下培養(yǎng)(分別為 C、D 組)。培養(yǎng) 24 h 后,倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài),行 HIF-1α 免疫熒光染色觀察,流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率,實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 檢測(cè) HIF-1α、Ⅱ 型膠原、蛋白多糖、SOX9 基因表達(dá),Western blot 檢測(cè)凋亡蛋白 HIF-1α、Bax、Bcl-2 表達(dá)。 結(jié)果 培養(yǎng) 24 h 后,A、B 組均見少量空泡壞死細(xì)胞;細(xì)胞凋亡率比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=1.026,P=0.471);B 組 HIF-1α 基因及蛋白相對(duì)表達(dá)量顯著高于 A 組(t=22.672,P=0.015;t=18.396,P=0.013);兩組 Bax、Bcl-2 蛋白表達(dá)比較,差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=0.594,P=0.781;t=1.251,P=0.342)。低氧培養(yǎng) 24 h 后,D 組空泡壞死細(xì)胞較 C 組增多,且可見大量 HIF-1α 陽(yáng)性終板軟骨細(xì)胞;與 C 組相比,D 組細(xì)胞凋亡率顯著增高(t=27.143,P=0.002),D 組 HIF-1α、Ⅱ型膠原、蛋白多糖、SOX9 基因表達(dá)較 C 組顯著降低(t=21.097,P=0.015;t=34.829,P=0.002;t=18.673,P=0.022;t=31.949,P=0.007),HIF-1α、Bcl-2 蛋白相對(duì)表達(dá)量較 C 組均顯著降低(t=37.648,P=0.006;t=16.729,P=0.036),而 Bax 蛋白表達(dá)較 C 組提高(t=25.583,P=0.011)。 結(jié)論 缺氧條件下,終板軟骨細(xì)胞中 HIF-1α 表達(dá)上調(diào),以提高細(xì)胞耐氧性;HIF-1α 可抑制終板軟骨細(xì)胞在低氧環(huán)境中發(fā)生凋亡。
目的 觀察δ阿片受體激動(dòng)劑D-丙2,D-亮5腦啡肽(D-Ala2,D-Leu5-enkephali,DADLE)對(duì)膿毒癥大鼠肝細(xì)胞凋亡及肝組織bcl-2和caspase-3表達(dá)的影響,探討DADLE對(duì)肝臟保護(hù)作用的可能機(jī)理。方法 采用盲腸結(jié)扎加穿孔(CLP)法制作大鼠膿毒癥模型,SD大鼠54只(雌雄不限),采用隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分為CLP組(n=18)、DADLE組(n=18)和假手術(shù)組(n=18)。在不同時(shí)間點(diǎn)(2、4及6 h)處死大鼠,原位末端標(biāo)記法檢測(cè)肝細(xì)胞凋亡情況,免疫組化法檢測(cè)肝組織中bcl-2及caspase-3蛋白表達(dá)的動(dòng)態(tài)變化并觀察肝臟的病理改變。結(jié)果 CLP組大鼠肝組織病理?yè)p害明顯較假手術(shù)組嚴(yán)重,DADLE組肝臟的病理變化明顯改善; CLP組大鼠肝組織細(xì)胞凋亡指數(shù)明顯較假手術(shù)組升高(P<0.01),以4 h最顯著(P<0.01),DADLE 組各時(shí)相肝細(xì)胞凋亡指數(shù)均明顯降低(P<0.01); CLP組大鼠肝組織caspase3蛋白的表達(dá)強(qiáng)度比假手術(shù)組明顯增強(qiáng)(P<0.01),而bcl-2蛋白的表達(dá)則明顯減弱(P<0.05); DADLE組肝組織caspase-3蛋白的表達(dá)強(qiáng)度較CLP組明顯減弱(P<0.01),而bcl-2蛋白的表達(dá)則明顯增強(qiáng)(P<0.05)。肝組織caspase-3的表達(dá)與肝細(xì)胞凋亡指數(shù)呈正相關(guān)(r=0.83,P<0.01),bcl-2的表達(dá)與肝細(xì)胞凋亡指數(shù)呈負(fù)相關(guān)(r=-0.65,P<0.01)。結(jié)論 DADLE能明顯改善膿毒癥大鼠肝臟的病理變化,其作用機(jī)理可能與DADLE下調(diào)caspase-3表達(dá)、上調(diào)bcl-2表達(dá),從而抑制肝細(xì)胞凋亡有關(guān)。