目的 以基因工程干細(xì)胞治療的方式來(lái)改善缺血-再灌注狀況，使移植肝臟更好地耐受缺血-再灌注，以減少移植術(shù)后的并發(fā)癥，延長(zhǎng)移植器官存活期。方法 利用已建立的Wistar大鼠冷缺血原位肝移植(OLT)模型，術(shù)中經(jīng)受體大鼠門靜脈輸入IL-13基因修飾的或未修飾的肝卵圓細(xì)胞（HOC）即轉(zhuǎn)染組和未轉(zhuǎn)染組，分別于術(shù)后1、3、7及14 d檢測(cè)受體大鼠肝臟功能變化、組織學(xué)變化、膽管上皮細(xì)胞(BEC)的增殖情況、α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-SMA)的表達(dá)、肝組織中HO-1 mRNA的表達(dá)，并觀察移植大鼠術(shù)后的存活情況。結(jié)果 轉(zhuǎn)入IL-13基因的HOC對(duì)冷保存損傷的肝臟有一定的保護(hù)作用； 術(shù)后7 d，肝移植組和未轉(zhuǎn)染組的α-SMA表達(dá)較轉(zhuǎn)染組明顯（Plt;0.05）； 術(shù)后3 d，未轉(zhuǎn)染組和轉(zhuǎn)染組的BEC增殖指數(shù)明顯低于肝移植組（Plt;0.05）。轉(zhuǎn)染組術(shù)后各時(shí)相點(diǎn)的HO-1 mRNA表達(dá)水平均明顯高于相應(yīng)時(shí)相點(diǎn)的其他各組的水平(Plt;0.05)； 移植術(shù)中經(jīng)門靜脈輸入HOC對(duì)缺血性膽管損傷所誘導(dǎo)的BEC增殖有一定的抑制作用，對(duì)BEC具有一定的保護(hù)作用； 肝移植組生存率明顯低于假手術(shù)組和轉(zhuǎn)染組(Plt;0.05)。結(jié)論 IL-13的持續(xù)表達(dá)能促進(jìn)術(shù)后移植肝內(nèi)HO-1 mRNA的表達(dá)，這有利于對(duì)供肝的保護(hù)，有利于受體大鼠術(shù)后肝功能的恢復(fù)。促進(jìn)HO-1 mRNA的表達(dá)是IL-13對(duì)BEC的具有保護(hù)作用的機(jī)理之一。
目的 構(gòu)建包含IL-13基因片段的慢病毒載體，培養(yǎng)IL-13基因工程大鼠肝干細(xì)胞(肝卵圓細(xì)胞,HOC,WB-F344細(xì)胞)，將IL-13基因重組至WB-F344細(xì)胞中，使之可分泌大鼠IL-13。方法 人工合成大鼠IL-13基因，利用pWPXL-MOD(TG-005)載體構(gòu)建包含大鼠IL-13基因片段的質(zhì)粒； 制備慢病毒穿梭質(zhì)粒及其輔助包裝元件載體質(zhì)粒，四質(zhì)粒載體(組成為pRsv-REV、pMDlg-pRRE、pMD2G及目的穿梭質(zhì)粒)分別進(jìn)行高純度無(wú)內(nèi)毒素抽提，共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，培養(yǎng)48 h后，收集富含慢病毒顆粒的細(xì)胞上清液，對(duì)其濃縮后得到高滴度的慢病毒濃縮液，定量PCR檢測(cè)病毒滴度。將構(gòu)建好的慢病毒感染W(wǎng)B-F344細(xì)胞，5 d后采用real-time PCR檢測(cè)WB-F344細(xì)胞中IL-13的表達(dá)水平，Western blot檢測(cè)重組蛋白表達(dá)水平。結(jié)果 成功構(gòu)建了IL-13過(guò)表達(dá)慢病毒載體，并獲得IL-13基因工程大鼠肝干細(xì)胞； 將IL-13基因重組至WB-F344細(xì)胞基因組中，并可在細(xì)胞中進(jìn)行轉(zhuǎn)錄，慢病毒感染W(wǎng)B-F344細(xì)胞存在IL-13 mRNA表達(dá)，可分泌大鼠IL-13。結(jié)論 構(gòu)建的基因工程WB-F344細(xì)胞能顯著分泌大鼠IL-13，感染后的WB-F344細(xì)胞的IL-13表達(dá)水平顯著高于感染前，滿足動(dòng)物實(shí)驗(yàn)要求。
摘要】目的 研究人白介素-13（hIL-13）對(duì)牛主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞（BAECs）表達(dá)細(xì)胞間黏附分子-1（ICAM-1）和E-選擇素的影響，為hIL-13應(yīng)用于誘導(dǎo)異種移植免疫耐受、減輕異種移植排斥反應(yīng)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 方法 用不同濃度的hIL-13（2、5、10、20及40 ng/ml）孵育 BAECs 2 h后，再與腫瘤壞死因子-α（TNF-α， 4 ng/ml）共孵育6 h或18 h； 應(yīng)用細(xì)胞酶聯(lián)免疫吸附分析方法(Cell-ELISA)檢測(cè)BAECs表面的E-選擇素和ICAM-1的表達(dá)； 用MTT方法測(cè)定hIL-13對(duì)BAECs活性的影響。 結(jié)果 用hIL-13在5~20 ng/ml濃度內(nèi)預(yù)處理BAECs后，能明顯抑制TNF-α誘導(dǎo)的E-選擇素與ICAM-1的表達(dá)，并呈現(xiàn)一定的劑量依賴性(P＜0.01)。經(jīng)不同濃度hIL-13處理的BAECs活性與未經(jīng)hIL-13處理者相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 結(jié)論 hIL-13能明顯抑制BAECs表達(dá)E-選擇素與ICAM-1，誘導(dǎo)異種移植的免疫耐受，且hIL-13對(duì)BAECs無(wú)損傷作用。