目的 構(gòu)建共表達(dá)增強(qiáng)型綠色熒光蛋白（enhanced green fluorescent protein，EGFP）基因和人胰島素（insulin）基因的慢病毒載體，探討其對(duì)人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞（human umbilical cord mesenchymal stem cells，hUCMSCs）的轉(zhuǎn)染情況，為今后組織工程脂肪構(gòu)建與體內(nèi)回植研究奠定基礎(chǔ)。 方法 采用DNA 重組技術(shù)，將insulin 基因克隆至帶EGFP 的慢病毒表達(dá)載體pLenti6.3- 內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)序列（internal ribosome entry site，IRES）-EGFP 中，篩選陽(yáng)性克隆，并用脂質(zhì)體介導(dǎo)法將慢病毒包裝系統(tǒng)和帶目的基因的質(zhì)粒pLenti6.3-insulin-IRES-EGFP 共同轉(zhuǎn)染到293T 細(xì)胞內(nèi)包裝病毒，熒光倒置相差顯微鏡觀察包裝細(xì)胞報(bào)告基因的表達(dá)情況。收集病毒上清，純化濃縮，測(cè)定重組病毒的滴度。取足月兒臍帶以組織塊培養(yǎng)法分離培養(yǎng)hUCMSCs，以不同感染復(fù)數(shù)（multiple of infection，MOI，分別為0、1、3、5、7、10、15、20）的重組慢病毒感染hUCMSCs，通過(guò)報(bào)告基因綠色熒光蛋白的表達(dá)篩選最適MOI；以最適MOI 重組慢病毒感染hUCMSCs，應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR 及Western blot 法分別檢測(cè)細(xì)胞中insulin 基因及insulin 蛋白水平的表達(dá)情況。 結(jié)果 成功構(gòu)建了共表達(dá)insulin 基因和EGFP 基因的重組慢病毒載體pLenti6.3-insulin-IRES-EGFP，并對(duì)其成功包裝、純化及濃縮，病毒滴度為1.3 × 108 TU/mL。不同MOI 的重組慢病毒感染hUCMSCs 后，通過(guò)綠色熒光蛋白表達(dá)的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)篩選其最適MOI 為10，此時(shí)對(duì)細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率可達(dá)到90%。實(shí)時(shí)熒光定量PCR 檢測(cè)示轉(zhuǎn)染組insulin mRNA 表達(dá)陽(yáng)性，未轉(zhuǎn)染組為陰性；Western blot 檢測(cè)示轉(zhuǎn)染組細(xì)胞內(nèi)及上清液insulin 蛋白表達(dá)陽(yáng)性，未轉(zhuǎn)染組均為陰性。 結(jié)論 構(gòu)建的攜帶insulin基因的重組慢病毒載體pLenti6.3-insulin-IRES-EGFP 可有效轉(zhuǎn)染hUCMSCs，表達(dá)insulin 蛋白。