目的 構(gòu)建同時表達綠色熒光蛋白（green fluorescent protein，GFP）報告基因和人類Nel1 型蛋白[homo sapiens NEL-like 1，NELL1）] 基因的重組腺病毒載體pAdxsi-GFP-NELL1，并轉(zhuǎn)染大鼠BMSCs，觀察其表達情況，為進一步研究NELL1 蛋白的成骨作用提供理論基礎。 方法 設計特異性引物從NELL1 質(zhì)粒中擴增NELL1，將測序正確的片段用XhoI/BglII 酶切處理，定向插入至pShuttle-GFP-CMV（-）TEMP 重組穿梭載體，然后將驗證正確的重組穿梭質(zhì)粒中的插入片段轉(zhuǎn)移至pAdxsi 載體構(gòu)建重組腺病毒載體質(zhì)粒，用PacI 限制性內(nèi)切酶線性化后轉(zhuǎn)染HEK293 細胞，擴增純化重組腺病毒，半數(shù)組織培養(yǎng)感染量法測定重組腺病毒滴度。培養(yǎng)大鼠BMSCs，采用流式細胞儀鑒定表面標志物，并行成骨、成脂誘導鑒定。用構(gòu)建的pAdxsi-GFP-NELL1 及空病毒pAdxsi-GFP（作為對照）轉(zhuǎn)染鑒定正確的BMSCs，RT-PCR 檢測NELL1 的表達，免疫熒光檢測GFP 基因及NELL1 的表達情況，細胞計數(shù)試劑盒（cell counting kit-8，CCK-8）法檢測對細胞增殖的影響。 結(jié)果 成功構(gòu)建同時表達NELL1 和GFP 基因的重組腺病毒載體（pAdxsi-GFP-NELL1），純化后獲得滴度達1 × 1011 pfu/mL 的重組腺病毒。成功分離獲得大鼠BMSCs 并傳代、純化，經(jīng)流式細胞儀鑒定表面標志物及成骨、成脂誘導鑒定為BMSCs。pAdxsi-GFP-NELL1 轉(zhuǎn)染BMSCs 后，RT-PCR 檢測示NELL1 mRNA 陽性表達，熒光顯微鏡觀察示細胞爬片GFP 陽性表達，NELL1 抗體免疫熒光觀察示NELL1 蛋白陽性表達。CCK-8 法鑒定顯示轉(zhuǎn)染后對BMSCs生長無明顯影響。 結(jié)論 構(gòu)建并純化后的重組腺病毒載體（pAdxsi-GFP-NELL1）可高效轉(zhuǎn)染大鼠BMSCs，并穩(wěn)定表達NELL1 和GFP 兩種基因，為進一步研究新的成骨基因NELL1 的作用，追蹤其在體內(nèi)、體外表達情況提供了新工具。
目的 對鎳鈦（NiTi）記憶合金植入物進行表面修飾是屏蔽Ni 離子釋放的有效方法，鈦鈮（TiNb）合金作為涂層材料不會影響NiTi 的超彈性和記憶效應。對TiNb 涂層的NiTi 記憶合金植入體植入骨組織后的骨組織生物相容性進行評價，為臨床應用提供實驗依據(jù)。 方法 對直徑4 mm、長12 mm 的NiTi 記憶合金圓柱體采用磁控濺射技術分別進行Ti 涂層和TiNb 涂層，另一組僅表面拋光清洗不進行涂層。取成年雜種犬15 只，體重（15 ± 2）kg，隨機分為3 組，每組5 只，分別為NiTi 組、Ti 涂層組和TiNb 涂層組。制備犬雙側(cè)股骨干假體植入模型，垂直股骨外側(cè)皮質(zhì)分別植入NiTi 無涂層、Ti 涂層和TiNb 涂層記憶合金圓柱體，每只犬植入10 枚，間距1.0 ～ 1.5 cm。術后12 個月處死動物取材，X 線片觀察植入體植入方向，未與股骨皮質(zhì)垂直的植入體標本作為無效標本放棄，其余有效標本一部分（NiTi 組、Ti 涂層組和TiNb 涂層組標本數(shù)分別為12、10 和14 枚）進行生物力學推出實驗，計算最大剪切強度；另一部分（NiTi 組、Ti 涂層組和TiNb 涂層組標本數(shù)分別為8、5 和10 枚）行不脫鈣切片用于組織學觀察和計算骨性結(jié)合率。 結(jié)果 Ti 涂層組和TiNb 涂層組的剪切強度分別為（95.10 ± 10.03）、（91.20 ± 15.42）MPa，明顯高于NiTi 組的（71.60 ± 14.24）MPa（P lt; 0.01）； 2 個涂層組間比較差異無統(tǒng)計學意義（P gt; 0.05）。Giemsa 染色示3 組植入體周圍均未見明顯巨噬細胞和中性粒細胞浸潤，偶爾可見少量淋巴細胞。NiTi 組、Ti 涂層組和TiNb 涂層組的骨性結(jié)合率分別為21.30% ± 0.23%、32.50% ± 0.31%和38.60% ± 0.58%，3 組間比較差異均有統(tǒng)計學意義（P lt; 0.01）。 結(jié)論 各植入體和骨組織均具有良好的生物相容性；Ti 涂層和TiNb 涂層的骨生物相容性相近，但從骨性結(jié)合率結(jié)果分析，TiNb 涂層的骨組織生物相容性更佳。
【摘 要】 目的 探討脫細胞軟骨基質(zhì)三維多孔支架的制備方法以及將其應用于關節(jié)軟骨組織工程的可行性。 方法 取天然人軟骨粉碎后，采用梯度離心法取100 nm ～ 5 μm 軟骨微絲，脫細胞處理后制備為質(zhì)量體積比為3%的懸液，采用冷凍凍干法制備脫細胞軟骨基質(zhì)三維多孔支架。254 nm 紫外線和碳化二亞胺/ N- 羥基琥珀酰亞胺對支架進行交聯(lián)。冷凍凍干后，對支架材料進行組織學及掃描電鏡觀察，測定支架孔徑和孔隙率、吸水率，并采用MTT 法分析支架浸提液毒性。分離培養(yǎng)犬BMSCs，用TGF-β1 成軟骨誘導后種植至支架，倒置顯微鏡、電鏡觀察細胞在支架上的生長、分化情況。 結(jié)果 組織學觀察顯示，三維多孔支架中無軟骨細胞碎片殘留，甲苯胺藍染色、番紅O 染色、Ⅱ型膠原免疫組織化學染色均呈陽性。掃描電鏡顯示支架內(nèi)孔洞相互連通，孔徑為（155 ± 34）μm，孔隙率為91.3% ± 2.0%，吸水率為451% ± 155%。MTT 法顯示不同濃度支架浸提液與對照DMEM 培養(yǎng)液吸光度值比較，差異無統(tǒng)計學意義（P gt; 0.05），支架無細胞毒性。倒置顯微鏡觀察，細胞在支架上黏附良好；掃描電鏡下細胞在支架上均勻分布，細胞呈圓形或橢圓形，并有基質(zhì)分泌。 結(jié)論 制備的脫細胞軟骨基質(zhì)三維多孔支架去細胞徹底，保留了軟骨ECM 主要成分，無毒，具備合適的孔徑和孔隙率，生物相容性良好，是軟骨組織工程良好的支架載體。