目的 觀察急性高眼壓模型兔眼不同眼壓狀態(tài)下視神經(jīng)軸漿運(yùn)輸?shù)母淖?。方?成年新西蘭大白兔24只，分為眼壓20、30、40 mm Hg（1 mm Hg=0.133 kPa）組和眼壓為10~15 mm Hg的對照組，每組均為6只兔。采用前房穿刺灌注法聯(lián)合壓力持續(xù)監(jiān)測法建立急性高眼壓模型。實(shí)驗(yàn)開始時(shí)，兔眼玻璃體腔中注射羅丹明異硫氰酸（RITC）標(biāo)記軸漿運(yùn)輸。持續(xù)3 h高眼壓后，過量麻醉處死兔后取下視神經(jīng)。熒光顯微鏡下觀察視神經(jīng)軸漿運(yùn)輸情況的改變。采用德國Leica公司 Q500IW圖像分析軟件對RITC進(jìn)行灰度定量分析，并對各眼壓組平均灰度值和篩板前、篩板區(qū)、篩板后350 mu;m區(qū)域灰度值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析處理。結(jié)果 RITC在視神經(jīng)中心呈順行標(biāo)記染色。不同眼壓組軸漿運(yùn)輸情況不同，隨著眼壓升高，軸漿運(yùn)輸能力減弱，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=159.3，P＜0.05）。篩板前區(qū)，各眼壓組間灰度值比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=0.2545,P＞0.05 ）。40 mm Hg組灰度值與對照組灰度值比較，在篩板區(qū)（t=5.684）和篩板后350 mu;m區(qū)域（t=5.124）差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；20、30 mm Hg組灰度值與對照組灰度值比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=1.747，P＞0.05 ）。結(jié)論 眼壓40 mm Hg持續(xù)3 h將導(dǎo)致視神經(jīng)軸漿運(yùn)輸改變，軸漿運(yùn)輸障礙部位以篩板區(qū)及以后的區(qū)域?yàn)橹鳌?/p>
目的 探討在體電穿孔輔助基因轉(zhuǎn)染視網(wǎng)膜色素上皮（RPE）細(xì)胞層和光感受器（PR）細(xì)胞層的可行性。方法 147只健康雄性Spragne-Dawley(SD)大鼠根據(jù)電穿孔刺激模式電壓值分為5、10、15、20、25、30、35 V組，右眼視網(wǎng)膜下腔注射增強(qiáng)型綠色熒光蛋白（EGFP）真核表達(dá)質(zhì)粒pEGFPN1為實(shí)驗(yàn)眼，左眼注射TE Buffer 為對照眼。各組根據(jù)不同轉(zhuǎn)染方向再分為RPE和PR兩個(gè)亞組。各組除電壓不同外，其余參數(shù)均為脈寬99 ms，脈沖間期0.5 s，連續(xù)5個(gè)脈沖。將帶有負(fù)電荷的質(zhì)粒在電場作用下，擬轉(zhuǎn)染到RPE細(xì)胞層，反向置電極，擬轉(zhuǎn)染到PR細(xì)胞層。轉(zhuǎn)染后7 d 取各組視網(wǎng)膜鋪片，熒光顯微鏡下觀察EGFP表達(dá)強(qiáng)弱、范圍及熒光細(xì)胞計(jì)數(shù)分析；采用蛋白質(zhì)免疫印跡法（Western blot）、實(shí)時(shí)逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）半定量觀察EGFP蛋白和mRNA的表達(dá)。結(jié)果 轉(zhuǎn)染后7 d，熒光顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，各組RPE亞組對照眼RPE細(xì)胞層內(nèi)均未見特異性熒光表達(dá)，實(shí)驗(yàn)眼可見綠色熒光表達(dá)；各組RPE亞組對照眼視網(wǎng)膜鋪片均未見熒光表達(dá)，實(shí)驗(yàn)眼視網(wǎng)膜鋪片均可見轉(zhuǎn)染了EGFP的RPE細(xì)胞。Western blot檢測顯示，隨電壓增加，EGFP蛋白與beta;-肌動蛋白條帶灰度相對比值呈上升趨勢。RT-PCR檢測顯示，各組均產(chǎn)生陽性擴(kuò)增條帶，隨電壓增高，EGFP mRNA與GADPH mRNA擴(kuò)增條帶灰度相對比值逐漸增高。結(jié)論 在體電穿孔方法可以有效輔助基因轉(zhuǎn)染大鼠RPE細(xì)胞層。
目的 構(gòu)建腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（BDNF）綠色熒光蛋白(GFP)融合表達(dá)質(zhì)粒，觀察其融合蛋白的特性。方法 將BDNF cDNA片段插入pcDNA3.1/NT-GFP-TOPO 真核表達(dá)質(zhì)粒，使其與GFP同處一個(gè)閱讀框架中，測序鑒定后，轉(zhuǎn)染培養(yǎng)的雪旺細(xì)胞，用免疫組織化學(xué)和蛋白質(zhì)印跡(Western botting)觀察外源性目的蛋白的表達(dá)情況，并用該質(zhì)?；铙w轉(zhuǎn)染視神經(jīng)切斷的大鼠模型，觀察所表達(dá)外源性蛋白的神經(jīng)保護(hù)作用。結(jié)果 測序證實(shí)質(zhì)粒構(gòu)建成功。Western botting結(jié)果顯示，BDNF-GFP融合蛋白表達(dá)一相對分子質(zhì)量為41times;103大小條帶。熒光顯微鏡下可見BDNF-GFP轉(zhuǎn)染的細(xì)胞發(fā)出綠色熒光，免疫組織化學(xué)染色后，可見綠色熒光與紅色熒光完全重合。轉(zhuǎn)染BDNF-GFP質(zhì)粒和GFP質(zhì)粒的大鼠視神經(jīng)切斷術(shù)后7 d存活視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞（RGC）分別為（1201plusmn;286）、（482plusmn;151）個(gè) /mm2，存活百分比分別為（51.39plusmn;12.24）%和（20.62plusmn;6.46）%；28 d時(shí)存活的RGC分別為（715plusmn;71）、（112plusmn;24）個(gè)/mm2，存活百分比分別為（30.59plusmn;3.04）%和（4.79plusmn;1.03）%。兩組存活百分比比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=3.144，11.378；P＜0.01）。結(jié)論 BDNF-GFP融合表達(dá)載體可以轉(zhuǎn)錄翻譯為一融合蛋白，該蛋白可自發(fā)綠色熒光，并具有BDNF的生物學(xué)活性。