【摘要】 目的 篩選人源喉癌Hep-2細(xì)胞株特異結(jié)合的短肽，作為喉癌靶向治療的載體。 方法 體外培養(yǎng)Hep-2細(xì)胞株作為靶細(xì)胞，人正常喉黏膜上皮細(xì)胞為吸附細(xì)胞；用噬菌體展示十二肽庫(kù)進(jìn)行3輪差減篩選，隨機(jī)挑取10個(gè)噬菌體克隆進(jìn)行測(cè)序；采用酶聯(lián)免疫吸附（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）法鑒定噬菌體與Hep-2細(xì)胞的結(jié)合活性；通過(guò)免疫熒光鑒定喉癌細(xì)胞特異性結(jié)合肽（F2）噬菌體陽(yáng)性克隆與喉癌細(xì)胞結(jié)合的特異性?！〗Y(jié)果 經(jīng)過(guò)3輪篩選后，噬菌體在靶細(xì)胞Hep-2上出現(xiàn)明顯富集；ELISA分析鑒定顯示5個(gè)陽(yáng)性克隆能與Hep-2細(xì)胞特異結(jié)合，其中F2噬菌體克隆對(duì)喉癌細(xì)胞的結(jié)合靶向性明顯高于對(duì)照細(xì)胞（Plt;0.05）； 免疫熒光顯色顯示，F(xiàn)2能特異性地與喉癌細(xì)胞結(jié)合。 結(jié)論 利用噬菌體展示肽庫(kù)技術(shù)，可以成功篩選到F2，其可能成為喉癌靶向治療的載體。【Abstract】 Objective To obtain the polypeptides specifically bound to laryngeal squamous cell carcinoma line (Hep-2) and use it as a potential therapeutic vector targeting laryngeal squamous cell carcinoma patients. Methods With the Hep-2 cells as the target cells and human normal laryngeal squamous epithelial cells (HNLE cells) as the absorber cells, 3 rounds of panning from a Ph.D.-12TM phage-display peptide library were carried out. Ten randomly selected phage clones were sent for sequence detection. The affinity of phage clones was detected by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). The positive phage clones (F2) specifically bound to Hep-2 were identified by immunofluorescence detection. Results After 3 rounds of screening, 5 positive phage clones showed specific binding to Hep-2 cells and the affinity of positive phage clones (F2) was significantly higher than that of the control groups (Plt;0.05). The results of immunofluorescence detection indicated that F2 could be specifically bound to Hep-2. Conclusions Phage display peptide libraries technique can successfully screen the peptide specifically bound to Hep-2 cell line. Thus, it provides a potential vector for targeting therapy of laryngeal squamous cell carcinoma patients.
目的對(duì)氟尿嘧啶(5-FU)炭納米粒新型制劑在大鼠體內(nèi)的淋巴靶向性進(jìn)行研究。方法采用反相高效液相色譜法測(cè)定大鼠經(jīng)腹腔注射5-FU炭納米粒新劑型與5-FU普通劑型(20 mg/kg體重)后大鼠體內(nèi)淋巴組織的藥物濃度。結(jié)果腹腔注射5-FU炭納米粒新劑型組中淋巴組織中藥物濃度高于5-FU普通劑型組，炭納米?？梢晕?-FU并被淋巴組織吞噬，體現(xiàn)出一定的淋巴靶向性，5-FU炭納米粒新劑型組中的5-FU在淋巴組織中持續(xù)時(shí)間較長(zhǎng)。結(jié)論5-FU炭納米粒注射液能顯著改善淋巴靶器官局部藥物濃度，具有較好的淋巴靶向性。
目的 構(gòu)建肝細(xì)胞肝癌特異性表達(dá)反向半胱氨酸蛋白酶3（r-Caspase-3）重組腺病毒，為肝細(xì)胞肝癌的基因治療提供新策略。方法 構(gòu)建甲胎蛋白（AFP）增強(qiáng)子和白蛋白 (ALB) 啟動(dòng)子腺病毒載體（pAdTrack-EAFP-PALB），然后將目的基因r-Caspase-3亞克隆到載體pAdTrack-EAFP-PALB上， 獲得重組腺病毒穿梭載體pAdTrack-EAFP-PALB /r-Caspase-3, 經(jīng)PmeⅠ酶切線性化后與pAdEasy-1同源重組，獲得重組腺病毒骨架pAdEasy-EAFP-PALB /r-Caspase-3； 鑒定正確的pAdEasy-EAFP-PALB/r-Caspase-3 經(jīng)PacⅠ酶切線性化后脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染AD293 細(xì)胞進(jìn)行包裝、擴(kuò)增，獲得病毒。綠色熒光蛋白(green fluorescent protein，GFP)監(jiān)測(cè)病毒滴度和感染效率； RT-PCR和Western blot 法檢測(cè)r-Caspase-3在HepG2細(xì)胞中的表達(dá)； SRB染色法評(píng)估重組腺病毒對(duì)HepG2細(xì)胞的抑制作用，初步觀察HepG2細(xì)胞凋亡狀況。結(jié)果 穿梭載體pAdTrack-EAFP-PALB/r-Caspase-3酶切、測(cè)序正確。穿梭載體、pAdEasy-1載體同源重組后PCR 及PacⅠ酶切鑒定結(jié)果表明pAdEasy-EAFP-PALB/r-Caspase-3 重組成功； 經(jīng)PacⅠ酶切線性化后，pAdEasy-EAFP-PALB/r-Caspase-3 轉(zhuǎn)染AD293 細(xì)胞即可觀察到GFP 的表達(dá)； 回收病毒可重復(fù)感染AD293 細(xì)胞，RT-PCR和Western blot 均可檢測(cè)到r-Caspase-3的表達(dá)，證實(shí)Ad-EAFP-PALB/r-Caspase-3病毒顆粒包裝成功； SRB染色檢測(cè)發(fā)現(xiàn)Ad-EAFP-PALB/r-Caspase-3具有凋亡誘導(dǎo)特異性。結(jié)論 靶向性Ad-EAFP-PALB/r-Caspase-3重組腺病毒構(gòu)建成功，并具有凋亡誘導(dǎo)靶向性，為進(jìn)一步研究靶向性r-Caspase-3基因治療肝細(xì)胞肝癌及其生物學(xué)功能奠定了基礎(chǔ)。
目的 研究pcDNA3/AFP/TK/Angio融合基因?qū)θ烁伟┘?xì)胞系SMMC-7721裸鼠移植瘤模型的靶向性治療作用。方法 建立人原發(fā)性肝癌裸鼠皮下移植瘤模型，將荷瘤裸鼠隨機(jī)分成腫瘤對(duì)照組、空質(zhì)粒組、丙氧鳥(niǎo)苷(GCV）組、pcDNA3/TK/Angio組及pcDNA3/AFP/TK/Angio組5組。于瘤體內(nèi)分別直接注射不同的質(zhì)粒，同時(shí)于裸鼠腹腔內(nèi)注射GCV，觀察不同時(shí)段皮下腫瘤的生長(zhǎng)情況并做病理學(xué)檢查，免疫組化法檢測(cè)腫瘤微血管密度（MVD）以及血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子（VEGF）的表達(dá)量，原位末端標(biāo)記(TUNEL)法檢測(cè)細(xì)胞原位凋亡。放免法檢測(cè)裸鼠血清甲胎蛋白（AFP）的變化，透射電鏡觀察腫瘤細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的變化。結(jié)果 裸鼠皮下成瘤率100%； pcDNA3/TK/Angio組及pcDNA3/AFP/TK/Angio組的腫瘤體積、血清AFP含量、腫瘤MVD和VEGF表達(dá)強(qiáng)度均明顯低于對(duì)照組、空質(zhì)粒組和GCV組（P＜0.05），細(xì)胞凋亡指數(shù)都明顯高于后3組（P＜0.05），可見(jiàn)較多的凋亡細(xì)胞。而pcDNA3/AFP/TK/Angio組的腫瘤體積、AFP、MVD及VEGF表達(dá)強(qiáng)度又明顯低于pcDNA3/TK/Angio組（P＜0.05），凋亡指數(shù)高于后者（P＜0.05）。結(jié)論 pcDNA3/AFP/TK/Angio融合基因系統(tǒng)可顯著抑制腫瘤的生長(zhǎng)，有望成為治療原發(fā)性肝癌的新型生物制劑之一。
目的構(gòu)建小鼠端粒酶催化亞單位啟動(dòng)子（murine telomerase catalytic subunit promoter,PmTERT）調(diào)控的結(jié)核桿菌抗原基因Ag85A腫瘤特異性慢病毒表達(dá)載體，為腫瘤靶向性免疫基因治療的研究奠定基礎(chǔ)。 方法用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）方法克隆PmTERT，用熒光素酶（luciferase）活性檢測(cè)方法研究PmTERT在小鼠和人腫瘤細(xì)胞及正常細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄活性。通過(guò)核酸分子克隆方法，分別構(gòu)建巨細(xì)胞病毒（cytomegalo virus，CMV）啟動(dòng)子和PmTERT調(diào)控的Ag85A基因慢病毒表達(dá)載體，并用基因測(cè)序和Western blot方法對(duì)重組載體進(jìn)行鑒定。 結(jié)果本研究克隆的331 bp大小的PmTERT在小鼠Lewis肺癌細(xì)胞、人A549肺癌細(xì)胞、EC-109食管癌細(xì)胞中均有轉(zhuǎn)錄活性，在小鼠NIH3T3胚胎成纖維細(xì)胞和人MRC-5胚腎成纖維細(xì)胞中無(wú)轉(zhuǎn)錄活性；成功構(gòu)建分別由CMV啟動(dòng)子和PmTERT調(diào)控的Ag85A基因慢病毒表達(dá)載體pLVX-Ag85A-CMV和pLVXAg85A-PmTERT；感染pLVX-Ag85A-CMV的Lewis細(xì)胞和NIH3T3細(xì)胞均有Ag85A蛋白表達(dá)，感染pLVX-Ag85APmTERT的Lewis細(xì)胞有Ag85A表達(dá)，感染pLVX-Ag85A-PmTERT的NIH3T3細(xì)胞無(wú)g85A表達(dá)。 結(jié)論P(yáng)mTERT具有腫瘤特異性轉(zhuǎn)錄活性，其驅(qū)動(dòng)的結(jié)核桿菌抗原基因可以在腫瘤細(xì)胞中靶向性表達(dá)。