【摘 要】 目的 音猬因子（Sonic hedgehog，Shh）介導(dǎo)的信號(hào)參與調(diào)控血管生成的重要環(huán)節(jié)。研究不同濃度的重組Shh-N（recombinant Shh N-termitant，rShh-N）對(duì)BMSCs表達(dá)和分泌VEGF和bFGF的影響。 方法 取健康3日齡SD大鼠骨髓分離培養(yǎng)BMSCs，體外擴(kuò)增至第3代，分別用含0、10、100、200 ng/mL rShh-N的L-DMEM培養(yǎng)BMSCs，作為A、B、C、D組。培養(yǎng)12、24、48、72 h后行ELISA法檢測(cè)各組上清液中VEGF和bFGF的濃度，實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)各組VEGF和bFGF mRNA的表達(dá)水平。 結(jié)果 在基因表達(dá)水平上，D組各時(shí)間點(diǎn)的VEGF和bFGF mRNA表達(dá)量均明顯高于A組（P lt; 0.05），且在12、48 h表達(dá)量高于24、72 h（P lt; 0.01）；C組在各時(shí)間點(diǎn)均促進(jìn)bFGF mRNA表達(dá)（P lt; 0.05），在24～72 h促進(jìn)VEGF mRNA表達(dá)（P lt; 0.05），且在72 h時(shí)表達(dá)量均最高（P lt; 0.01）；B組在12 h抑制VEGF mRNA表達(dá)（P lt; 0.05），48 h和72 h表現(xiàn)出促進(jìn)作用（P lt; 0.05），在12～48 h明顯促進(jìn)bFGF mRNA表達(dá)（P lt; 0.05），且在48 h時(shí)的表達(dá)量最高（P lt; 0.01）。在蛋白水平上，D組各時(shí)間點(diǎn)VEGF和bFGF分泌量均高于A組（P lt; 0.01）；C組在24～72 h VEGF和bFGF分泌量明顯多于A組（P lt; 0.05）；B組在12 h和48 h抑制VEGF的分泌（P lt; 0.05），24 h增加其分泌作用（P lt; 0.05），而在24 h和48 h促進(jìn)bFGF的分泌（P lt; 0.05）。各組在48 h和72 h時(shí)的VEGF和bFGF分泌量明顯多于12 h和24 h（P lt; 0.05）。 結(jié)論 rShh-N可促進(jìn)BMSCs表達(dá)和分泌VEGF和bFGF，為進(jìn)一步探討rShh-N和MSCs聯(lián)合應(yīng)用于治療缺血性相關(guān)疾病以及促進(jìn)骨修復(fù)重建的可行性提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
目的明確音猬因子（Sonic hedgehog，Shh）在毛囊干細(xì)胞（hair follicle stem cells，HFSCs）傳代過程中的表達(dá)水平，分析過表達(dá)Shh對(duì)HFSCs增殖活性的影響，探究過表達(dá)Shh后HFSCs的存活情況及其對(duì)毛囊再生的影響。 方法取20例40～50歲女性脫發(fā)患者捐贈(zèng)的頭皮正常區(qū)（H1組）和脫發(fā)區(qū)（H2組）毛發(fā)，顯微鏡下剪取毛囊中間部分培養(yǎng)，獲取原代HFSCs并傳代；流式細(xì)胞術(shù)鑒定第4代HFSCs表面陽性標(biāo)志物（CD29、CD71）和陰性標(biāo)志物（CD34）。過表達(dá)Shh慢病毒轉(zhuǎn)染兩組HFSCs，并分別用流式細(xì)胞術(shù)和細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒8法測(cè)定轉(zhuǎn)染前后的細(xì)胞周期和增殖活性。然后將Shh慢病毒轉(zhuǎn)染后的HFSCs移植至裸鼠背部皮下作為實(shí)驗(yàn)組，以注射等量生理鹽水作為對(duì)照組，5周后采用Western blot法檢測(cè)裸鼠背部皮膚組織內(nèi)Shh蛋白表達(dá)情況，HE染色和免疫熒光染色分別比較各組毛囊數(shù)量及HFSCs存活情況。 結(jié)果 分離培養(yǎng)的細(xì)胞呈長(zhǎng)梭形，貼壁較牢；流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)示CD29和CD71在細(xì)胞表面呈高表達(dá)，CD34呈低表達(dá)；提示培養(yǎng)細(xì)胞為HFSCs。實(shí)時(shí)熒光定量PCR和Western blot檢測(cè)示，H1組和H2組第4、7、10代細(xì)胞中Shh蛋白和基因表達(dá)水平隨體外培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)而逐漸下降。過表達(dá)Shh后兩組HFSCs增殖活性均顯著高于空白組（未轉(zhuǎn)染慢病毒）和陰性對(duì)照組（轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照慢病毒），且H1組HFSCs轉(zhuǎn)染前后增殖活性均顯著高于H2組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。裸鼠細(xì)胞移植5周后，各實(shí)驗(yàn)組背部皮膚內(nèi)Shh蛋白穩(wěn)定表達(dá)；各實(shí)驗(yàn)組毛囊數(shù)量和HFSCs標(biāo)記物（CD71、細(xì)胞角蛋白15）表達(dá)水平均顯著多于對(duì)照組，且實(shí)驗(yàn)組中的H1組毛囊數(shù)量和HFSCs標(biāo)記物表達(dá)水平均顯著多于H2組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。 結(jié)論慢病毒介導(dǎo)的Shh可成功轉(zhuǎn)染人HFSCs，過表達(dá)Shh后HFSCs增殖活性顯著升高，能持續(xù)穩(wěn)定地分泌和表達(dá)Shh，并結(jié)合干細(xì)胞和Shh的優(yōu)勢(shì)共同促進(jìn)毛囊再生。