目的 探討CPC 作為rhBMP-2 載體促進家兔脊柱融合的作用及效果。 方法 取1 mg rhBMP-2分別與1 g CPC、體積為6.0 cm × 2.0 cm × 0.5 cm 的醫(yī)用明膠海綿（absorbable gelatin sponge，AGS）吸附復合，凍干制備rhBMP-2/CPC、rhBMP-2/AGS 生物材料。45 只24 周齡新西蘭兔，體重2.5 ～ 3.5 kg，隨機分為A（n=17）、B（n=11）、C（n=17）3 組。暴露L5、6 橫突，將L5、6 橫突后緣骨皮質(zhì)磨除，露出松質(zhì)骨，行后路雙側(cè)L5、6 橫突間植骨，A、B、C 組分別植入rhBMP-2/CPC、rhBMP-2/AGS、CPC 3 種材料。于術(shù)后4、8、24 周，行大體、組織學觀察及影像學檢查。 結(jié)果 術(shù)后4、8周脫鈣組織切片，A 組均見明顯骨痂連接；B 組僅見小片骨痂；C 組見纖維連接，局部少許軟骨。術(shù)后4 周A、B、C 組脫鈣組織切片評分分別為（7.30 ± 0.76）、（3.68 ± 1.60）和（1.75 ± 0.54）分，術(shù)后8 周分別為（8.32 ± 1.11）、（3.75 ± 1.23）和（1.47 ±0.23）分；各時間點A、B 組以及A、C 組比較，差異均有統(tǒng)計學意義（P lt; 0.05）。不脫鈣硬組織切片術(shù)后4、8 周A 組均見類松質(zhì)骨樣骨組織再生，C 組植入物周圍見纖維連接，少許成骨。術(shù)后4 周單位面積內(nèi)成骨面積A、C 組間比較差異無統(tǒng)計學意義（P gt; 0.05）； 術(shù)后8 周，A、C 組間比較差異有統(tǒng)計學意義（P lt; 0.05）。三維重建CT 評分A、B、C 組分別為（2.50 ±0.57）、（1.00 ± 0.00）和（1.00 ± 0.00）分，C 組與A、B 組以及A、B 組間比較差異均有統(tǒng)計學意義（P lt; 0.05）。 結(jié) 論 CPC作為rhBMP-2 載體能夠促進家兔脊柱骨性融合，可作為一種新型的人工骨修復材料。
目的 探討負載rhBMP-2 的CPC 活性人工骨修復骨缺損的臨床應用，評價其臨床使用效果和安全性。 方法 2006 年6 月－ 2007 年9 月，采用負載rhBMP-2 的CPC（rhBMP-2/CPC 組）和單純CPC（對照組）修復骨缺損112 例，骨缺損范圍為1 cm × 1 cm × 1 cm～ 4 cm × 3 cm × 3 cm。其中對照組63 例，男31 例，女32 例；年齡17 ～ 70 歲，平均47.4 歲。骨缺損部位：跟骨19 例，脛骨平臺20 例，肱骨近端8 例，橈骨遠端9 例，胸腰椎7 例。rhBMP-2/CPC 組49 例，男31 例，女18 例；年齡16 ～ 68 歲，平均45.6 歲。骨缺損部位：跟骨11 例，脛骨平臺16 例，肱骨近端7 例，橈骨遠端2 例，脛骨遠端2 例，胸腰椎11 例。術(shù)中采用負載rhBMP-2/CPC（2 ～ 5 g）或單純CPC（2 ～ 50 g）填充骨缺損。 結(jié)果 術(shù)后108 例傷口Ⅰ期愈合；術(shù)后2 周對照組1 例及rhBMP-2/CPC 組3 例傷口有淡黃色清亮稀薄分泌物滲出，經(jīng)換藥及激素治療后愈合。所有患者未見毒性反應，無皮疹或高熱，肝腎功能、血、尿常規(guī)及C 反應蛋白均正常。112 例均獲隨訪，隨訪時間12 ～ 24 個月，平均13.2 個月。隨訪期間未發(fā)生骨髓炎，無再骨折，無明顯骨缺損修復后再塌陷，無鋼板及螺釘松動、斷裂等并發(fā)癥，脊柱手術(shù)的椎體前緣無高度不足發(fā)生。兩組術(shù)后3 個月骨折均達骨性愈合，無延遲愈合或骨不連發(fā)生?；贾顒忧闆r良好，屈伸功能達正?；顒铀?。 結(jié)論 負載rhBMP-2 的CPC 活性人工骨修復骨缺損安全、有效，是一種理想的骨缺損修復材料。
目的 探討重組質(zhì)粒pIRES-hBMP-2-hVEGF165 體外轉(zhuǎn)染對hBMSCs 成骨誘導分化的影響。 方 法 構(gòu)建hBMP-2 和hVEGF165 真核共表達載體。取健康成人自愿捐獻的骨髓分離培養(yǎng)hBMSCs，采用陽離子脂質(zhì)體將構(gòu)建的質(zhì)粒pIRES-hBMP-2-hVEGF165、pIRES-hBMP-2、pIRES-hVEGF165 和空質(zhì)粒載體（pIRES-neo）轉(zhuǎn)染至hBMSCs，作為A、B、C、D 組；另取相同數(shù)量的未轉(zhuǎn)染細胞作為對照組（E 組）。培養(yǎng)4 周，采用RT-PCR 檢測hBMP-2、hVEGF165 以及骨鈣mRNA 表達，Western blot 檢測細胞 hBMP-2 和 hVEGF165 表達，定量檢測ALP 活性，免疫組織化學方法檢測Col Ⅰ表達。 結(jié) 果 與E 組比較，A 組hBMSCs 高表達hBMP-2、hVEGF165、Col Ⅰ及骨鈣素，B 組大量表達骨鈣素及Col Ⅰ，C組高表達hVEGF165，而B 組hVEGF165 及C 組hBMP-2 和Col Ⅰ的表達與D、E 組相似，呈陰性或僅有痕量表達。A、B、C、D 及E 組ALP 活性分別為0.91 ± 0.03、0.90 ± 0.02、0.64 ± 0.03、0.67 ± 0.01、0.66 ± 0.02，A、B 組與E 組比較差異有統(tǒng)計學意義（P lt; 0.05），C、D、E 組差異無統(tǒng)計學意義（P gt; 0.05）。 結(jié)論 重組質(zhì)粒通過陽離子脂質(zhì)體能成功轉(zhuǎn)染hBMSCs，外源性hBMP-2 和 hVEGF165 基因在轉(zhuǎn)染細胞中能持續(xù)表達，并能增強hBMSCs 的成骨能力。
【摘 要】 目的 以PLGA 和膠原海綿為載體，分別復合rhBMP-2，比較兩者修復兔關(guān)節(jié)軟骨缺損的效果。 方法 將PLGA和膠原海綿制成直徑4 mm、厚3 mm的圓柱形，分別與0.5 mg rhBMP-2 復合。2 月齡新西蘭兔24 只，雌雄不拘，體重1.8 ～ 2.3 kg，平均2.0 kg。于24 只兔雙側(cè)股骨髁部制造直徑4 mm 的缺損，其中18 只動物右側(cè)缺損處植入PLGA/rhBMP-2 復合物（實驗1 組），左側(cè)缺損處植入膠原海綿/rhBMP-2 復合物（實驗2 組） ；余6 只動物（12 個膝關(guān)節(jié)）缺損不作任何處理，作為空白對照組。術(shù)后4、12 和24 周取材，行大體及組織學觀察，并根據(jù)關(guān)節(jié)軟骨半定量評分標準進行組織學評分。 結(jié)果 大體及組織學觀察：4 周，實驗1 組缺損內(nèi)被半透明組織填充；實驗2 組缺損未被新生組織填滿，兩組形成的軟骨組織與周圍界限明顯, 軟骨細胞分布較均一，排列無方向性；對照組中形成少量纖維組織。12 周，實驗1 組缺損內(nèi)完全充填白色半透明新生軟骨組織，與正常軟骨界限不清；實驗2 組缺損內(nèi)形成白色半透明軟骨組織，與周圍正常軟骨界限仍可辨認；兩組新生軟骨厚度逐漸接近正常軟骨厚度，表面細胞平行排列，深層細胞排列較紊亂，基質(zhì)異染，軟骨下骨及潮線恢復，與正常軟骨連接良好；對照組缺損邊緣及底部形成少量軟骨細胞，分布不均勻，底部纖維組織不連續(xù)。24 周，實驗1 組缺損內(nèi)形成半透明新生軟骨組織，與正常軟骨界限消失；實驗2 組形成的新生軟骨組織顏色、質(zhì)地與12 周接近；兩組新生軟骨與正常軟骨厚度相近，表面平整，細胞排列均一，但較紊亂，基質(zhì)異染，軟骨下骨及潮線恢復，與正常軟骨連接良好；對照組缺損底部形成一層纖維組織，不連續(xù)。組織學評分：實驗1 組、實驗2 組與對照組在各時間點比較，差異均有統(tǒng)計學意義（P lt; 0.01）；兩個實驗組12、24 周與4 周比較差異有統(tǒng)計學意義（P lt; 0.01），但12 周和24 周比較差異無統(tǒng)計學意義（P gt; 0.05）；同一時間點兩實驗組間比較差異無統(tǒng)計學意義（P gt; 0.05）。 結(jié)論 PLGA 和膠原海綿與rhBMP-2 復合均可修復關(guān)節(jié)軟骨缺損。
【摘 要】 目的 評價HA 復合rhBMP-2 的腺病毒（adenovirus mediated rhBMP-2，Adv-rhBMP-2）轉(zhuǎn)染的羊BMSCs 對骨痂延長骨愈合的影響。 方法 成年山羊19 只，雌雄不限，體重15 ～ 20 kg。于每只羊髂嵴上穿刺抽取骨髓10 mL，常規(guī)傳代培養(yǎng)BMSCs。取第3 代BMSCs，以感染復數(shù)200 轉(zhuǎn)染腺病毒。取0.25% 胰蛋白酶消化轉(zhuǎn)染后3 d 的細胞1 ×108 個，與HA 充分混勻制備Adv-rhBMP-2/BMSCs/HA。建立山羊右側(cè)脛骨延長模型，術(shù)后立即于截骨部位注射自體細胞復合物。按術(shù)后注入物質(zhì)不同隨機分成4 組：A 組為Adv-rhBMP-2/BMSCs/HA 組（n=6），B 組為Adv-rhBMP-2/BMSCs 組（n=5），C 組為Adv-β-gal/BMSCs/HA 組（n=4），D 組為空白組（n=4）。術(shù)后第7 天開始行脛骨延長，速度1 mm/d，共延長4 周。術(shù)后5、8、12 周攝X 線片觀察骨痂生長情況，12 周處死動物，取標本分別行骨密度檢測、生物力學測定、組織學觀察和骨形態(tài)計量學分析。 結(jié)果 X 線片檢查示，術(shù)后5、8 周A、B 組骨痂生成量明顯多于C、D 組，X 線片定量評分A、B 組明顯高于C、D 組，差異均有統(tǒng)計學意義（P lt; 0.05）；12 周各組均在骨延長部位形成連續(xù)骨痂。骨密度測定：術(shù)后12 周A、B、C、D 組延長部位骨礦物質(zhì)含量分別為（4.175 ± 1.921）、（2.600 ± 0.638）、（2.425 ± 0.826）和（1.175 ± 0.574） g，骨礦物質(zhì)密度分別為（0.612 ± 0.196）、（0.630 ± 0.159）、（0.450 ± 0.166）和（0.266 ± 0.113）g/cm2，A、B 組顯著高于C、D組（P lt; 0.05）。生物力學測定：A、B、C、D 組最大載荷分別為（490.20 ± 155.08）、（350.59 ± 80.48）、（221.95 ± 68.79）和（150.65 ± 92.29）N，彈性模量為（178.24 ± 105.80）、（105.88 ± 27.09）、（81.18 ± 48.67）和（50.35 ± 47.64）MPa，各指標A組顯著高于C、D 組（P lt; 0.05）。組織學觀察見A 組骨延長處大量新生骨組織，骨小梁多為縱行網(wǎng)狀排列。骨形態(tài)計量分析示A、B、C、D 組新骨體積分別為72.35% ± 5.68%、67.58% ± 7.42%、49.63% ± 4.87% 和38.87% ± 2.35%，A 組新生骨生成量明顯比D 組多（P lt; 0.05）。 結(jié)論 HA 復合rhBMP-2 修飾的BMSCs 制備的組織工程骨可促進羊脛骨延長骨愈合。
【摘 要】 目的 研究以聚-DL- 乳酸（poly-D,L-lactic acid，PDLLA）為載體復合rhBMP-2 接骨板的制備，并觀察其生物相容性，為臨床應用提供理論依據(jù)。 方法 將rhBMP-2 以0.05 mg/ 板與PDLLA 真空負壓抽吸復合，制備復合rhBMP-2 的PDLLA 接骨板。新西蘭大白兔32 只，雌雄不限，體重（3.0 ± 0.5） kg。制備雙側(cè)尺骨中段2.5 mm 骨及骨膜缺損模型。取右側(cè)為實驗組（n=32），采用復合rhBMP-2 的PDLLA 接骨板固定尺骨骨折處；左側(cè)為對照組（n=32），采用普通PDLLA 接骨板固定。于術(shù)后2、4、8 和12 周行大體、X 線片和組織學觀察，比較復合rhBMP-2 的PDLLA 接骨板與普通PDLLA 接骨板的生物相容性。 結(jié)果 復合rhBMP-2 的PDLLA 接骨板孔隙率為90%，孔徑150 μm，拉伸強度gt; 50 MPa，三點抗彎強度gt; 90 MPa，特性黏度1.6 dL/g（氯仿溶劑）。動物切口均于1 ～ 2 周Ⅰ期愈合，動物飲食及活動恢復正常，無肢體活動受限及跛行。兩種接骨板均固定牢固，骨折端無移位，材料逐步降解，實驗組接骨板降解較對照組快。X 線片：實驗組術(shù)后2、4、8 及12 周骨折修復的X 線阻射密度值分別為39.22 ± 2.48、48.79 ± 1.26、63.78 ± 1.78 及78.60 ± 1.25；對照組分別為33.83 ± 1.13、41.28 ± 1.25、55.23 ± 0.68 及66.54 ± 1.33，兩組各時間點比較，差異均有統(tǒng)計學意義（P lt; 0.01）。組織學觀察，實驗組接骨板與周圍組織的相容性、成骨速度、骨再生量、再生髓腔結(jié)構(gòu)等方面均優(yōu)于對照組；實驗組術(shù)后2、4、8 及12 周骨缺損區(qū)新骨形成面積百分比分別為0.106% ± 0.015%、0.292% ± 0.019%、0.457% ± 0.048%及0.601% ± 0.037%；對照組分別為0、0.193% ± 0.019%、0.339% ± 0.029% 及0.574% ± 0.047%；不同時間點兩組比較差異均有統(tǒng)計學意義（P lt; 0.05）。 結(jié)論 復合 rhBMP-2 的PDLLA 接骨板生物相容性良好，較之普通PDLLA 接骨板具有更良好骨誘導性和骨折修復能力。
目的 構(gòu)建可誘導表達hBMP-2 的慢病毒載體，并研究hBMP-2 在人臍血間充質(zhì)干細胞（human umbilical cord blood mesenchymal stem cells，HUMSCs）中的可誘導性表達。 方法 以pcDNA-hBMP-2 為模板，通過PCR 反應獲取hBMP-2，運用GATEWAY 技術(shù)構(gòu)建pLV/EXPN2-Neo-TRE-hBMP-2、pLV/EXPN2-Puro-EF1A- 反向反式激活因子（reverse transactivator，rtTA），通過PCR 鑒定重組慢病毒載體構(gòu)建。將重組慢病毒與輔助質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)染293FT 細胞，包裝成能表達hBMP-2 的可控性慢病毒，并測定病毒滴度。用病毒轉(zhuǎn)染HUMSCs，使用強力霉素進行誘導，分別在相同誘導時間（48 h）不同誘導濃度（0、10、100 ng/mL，1、10、100 μg/mL）及不同誘導時間（12、24、48、72 h）相同誘導濃度（10 μg/mL）兩種情況下用ELISA 法測定hBMP-2 的表達情況。對轉(zhuǎn)染前后的HUMSCs 進行成骨誘導，用茜素紅染色法觀察礦化物結(jié)節(jié)形成情況。 結(jié)果 成功構(gòu)建了攜帶hBMP-2 的可控性慢病毒載體pLV/EXPN2-Neo-TRE-hBMP-2、pLV/EXPN2-Puro-EF1A-rtTA，并獲得相應的病毒，病毒滴度分別為3.5 × 108 TU/mL 和9.5 × 107 TU/mL；病毒轉(zhuǎn)染HUMSCs 后，HUMSCs 可通過強力霉素的誘導可控性表達hBMP-2。在相同誘導時間情況下，強力霉素10 μg/mL 時誘導表達最強；而在相同誘導濃度下，hBMP-2 的表達在誘導48 h 達峰值。HUMSCs 成骨誘導培養(yǎng)2 周后，茜素紅染色示胞漿中有大量紅色的鈣化基質(zhì)沉積。 結(jié)論 通過GATEWAY 技術(shù)可以建立攜帶hBMP-2 目的基因的可控性慢病毒載體，為進一步研究hBMP-2 誘導HUMSCs 成骨分化治療骨壞死模型奠定實驗基礎(chǔ)，并提供了一種新的實驗思路。