目的 構(gòu)建轉(zhuǎn)化生長因子 β3（transforming growth factor β3，TGF-β3）的腺病毒載體，并通過腺病毒載體將TGF-β3基因轉(zhuǎn)染骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（marrow mesenchymal stem cells，MSCs），使其在細(xì)胞內(nèi)得到表達(dá)。方法 將人TGF--3質(zhì)粒定向克隆進(jìn)入穿梭質(zhì)粒pAdTrackCMV中，與pAdEasy1共同轉(zhuǎn)入細(xì)菌并重組，獲得TGF-β3重組腺病毒質(zhì)粒，用脂質(zhì)體法導(dǎo)入包裝細(xì)胞HEK293中，48～96 h后熒光顯微鏡下觀察綠色熒光蛋白的表達(dá)。取1 月齡新西蘭大白兔5 只，取其脛骨骨髓。采用密度梯度離心法分離純化MSCs，并進(jìn)行傳代。取傳至第3代細(xì)胞采用TGF-β3腺病毒載體轉(zhuǎn)染，10 h后熒光顯微鏡觀察綠色熒光表達(dá)，轉(zhuǎn)染TGF-β3重組腺病毒4d后的MSCs用免疫細(xì)胞化學(xué)方法觀察TGF-β3在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)。結(jié)果 pAdEasy-TGF-β3轉(zhuǎn)染 HEK293 細(xì)胞48~96 h后，熒光顯微鏡可見明顯的綠色熒光表達(dá)。 兔骨髓分離培養(yǎng)10 d 后，培養(yǎng)MSCs融合達(dá)70％~80%、貼壁緊密，細(xì)胞形態(tài)均一，似成纖維細(xì)胞；14 d 完成原代細(xì)胞培養(yǎng)。TGF-β3重組腺病毒轉(zhuǎn)染MSCs 17 h 后，熒光顯微鏡下出現(xiàn)少量綠色熒光，48~72 h 熒光加強(qiáng)，熒光與MSCs輪廓一致。免疫細(xì)胞化學(xué)觀察，轉(zhuǎn)染TGF-β3重組腺病毒MSCs胞漿內(nèi)有棕黃色陽性顆粒表達(dá)。結(jié)論 TGF-β3基因重組腺病毒載體的成功構(gòu)建并在MSCs內(nèi)的表達(dá)，為創(chuàng)傷愈合的基因治療提供了研究基礎(chǔ)。
【摘 要】 目的 通過將轉(zhuǎn)染TGF-β3c2s2 基因的兔BMSCs 移植于兔耳瘢痕模型，觀察轉(zhuǎn)基因BMSCs 對創(chuàng)面愈合后增生性瘢痕形成的影響。 方法 成年健康日本大耳白兔20 只，體重1.7 ～ 2.5 kg，雌雄不拘。取第3 代兔BMSCs，經(jīng)Ad-TGF-β3c2s2 在感染復(fù)數(shù)150 下轉(zhuǎn)染，培養(yǎng)孵育24 h 后，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×105/mL 備用。將純化、濃縮的Ad-TGF-β3c2s2顆粒，DMEM/F12（不含F(xiàn)BS）稀釋為1×108 pfu/mL 備用。于20 只日本大耳白兔雙側(cè)兔耳分別制備兩個(gè)2 cm × 2 cm 大小的腹側(cè)全層皮膚、軟骨缺損創(chuàng)面。將每只兔的4 個(gè)創(chuàng)面隨機(jī)分為空白對照組（A組）、Ad-TGF-β3c2s2 組（B組）、BMSCs 組（C組）和BMSCs/Ad-TGF-β3c2s2 組（D 組），并以自身正常皮膚作為正常對照（E 組）。將備好的細(xì)胞及病毒液分別按創(chuàng)面分組進(jìn)行局部移植。于術(shù)后21、45、90 d 行大體觀察、瘢痕硬度和厚度測定、HE 染色和免疫組織化學(xué)檢測。 結(jié)果 大體觀察：A、B、C 組上皮化后創(chuàng)面均逐漸形成不同程度的瘢痕，傷后45 d 瘢痕增生程度達(dá)高峰，明顯高出皮膚表面，持續(xù)至90 d，D 組在觀察期內(nèi)均無明顯高出周圍皮膚的瘢痕形成。術(shù)后45 d 和90 d，A、B、C 組瘢痕厚度和硬度明顯高于D 組，且差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P lt; 0.01），而B 組低于A、C 組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P lt; 0.01）；D 組愈合后創(chuàng)面厚度和硬度與正常皮膚接近。HE 染色觀察：A、C 組傷后45 d 可見淺層組織結(jié)構(gòu)排列紊亂，膠原纖維粗大，呈交錯(cuò)網(wǎng)織狀排列；B 組和D組結(jié)構(gòu)與正常皮膚接近，但較E 組膠原排列致密，表皮較A、C 組??；90 d 各組結(jié)構(gòu)與45 d 相似。BrdU 免疫組織化學(xué)觀察，傷后21、45 d，C、D 組均能見到散在分布、胞核染色陽性的棕色細(xì)胞，A、B、E 組均為陰性。 結(jié)論 創(chuàng)面局部移植人TGF- β3c2s2 基因修飾的BMSCs，具有抑制創(chuàng)面愈合后增生性瘢痕的作用。
本研究目的是探討超順磁性殼聚糖FGF-2明膠微球(SPCFGM)對小鼠間充質(zhì)干細(xì)胞增殖分化作用的影響。采用化學(xué)共沉淀法制備超順磁性氧化鐵殼聚糖納米粒子(SPIOCNs),與質(zhì)粒FGF-2結(jié)合后,用乳化交聯(lián)法制備SPCFGM和不含質(zhì)粒FGF-2的超順磁性殼聚糖明膠微球(SPCGM),激光粒度分析儀和透射電鏡檢測SPCFGM、SPIOCNs表征,測定SPCFGM的載藥量、包封率及體外釋放活性,分別用等量SPCFGM、SPCGM、加入C3H10細(xì)胞培養(yǎng)基中,設(shè)SPCFGM組、SPCGM組、空白對照組3組細(xì)胞。DAPI染色觀察細(xì)胞凋亡,Western blot法驗(yàn)證各組FGF-2的表達(dá)水平,CCK8法和流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞的增殖活力及細(xì)胞周期分布。結(jié)果顯示:SPIOCNs微粒和SPCFGM微球都呈球形,粒徑分別為(25±9) nm和(140±12) μm。SPCFGM的載藥量為57.13%±5.41%,包封率為69.97%±0.04%。3組細(xì)胞無凋亡形態(tài),SPCFGM組FGF-2蛋白水平表達(dá)較其它兩組明顯增高,細(xì)胞增殖活力明顯增高(P＜0.05)。SPCFGM可釋放FGF-2,并保持FGF-2的生物活性,促進(jìn)C3H10細(xì)胞增殖分化,對細(xì)胞無毒副作用。