目的 觀察光損傷后人視網(wǎng)膜色素上皮（RPE）細胞血管內(nèi)皮生長因子A（VEGF-A）及其受體可溶性fm樣酪氨酸激酶受體（sFlt-1）和包含激酶植入?yún)^(qū)域受體（KDR）的表達。方法 體外培養(yǎng)人RPE細胞，取第8~12代生長良好的傳代細胞用于實驗。將同代細胞隨機 分為對照組和光損傷組。以18 W冷白色熒光燈作為光源，自制光照器。采用雙層高壓消毒錫紙包裹對照組細胞，與光損傷組細胞一同置于自制光照器下，控制光照強度在（2200±300） Lux，持續(xù)光照12 h建立光損傷模型。于光損傷后0、6、12、24 h終止培養(yǎng)，采用逆轉錄聚合酶鏈反應（RT-PCR）和蛋白免疫印跡法（Western blot）檢測VEGF-A、sFlt-1及KDR 的mRNA及蛋白表達。結果 光損傷組VEGF-A mRNA及蛋白表達在光損傷后6 h時明顯增加，12 h時達到高峰，明顯高于對照組（t=2.74，2.93；P＜0.05），隨后降低。sFlt-1的mRNA及蛋白表達在光損傷后12 h達到高峰，明顯高于對照組（t=4.32，P＜0.01）；24 h時 明顯低于對照組（t=2.41，P＜0.05）。KDR的mRNA及蛋白表達在光損傷后6、12 h時較對照組無明顯變化(t=1.84，P＞0.05)，24 h時高于對照組（t=2.89，P＜0.05）。 〖HTH〗結論光損傷后6、12 h時，RPE細胞VEGF-A及sFlt-1的表達明顯增高，KDR的表達相對穩(wěn)定。光損傷后24 h時，RPE細胞VEGF-A及sFlt-1的表達降低，KDR的表達增高。
目的 觀察持續(xù)頻閃光刺激對發(fā)育敏感期豚鼠視網(wǎng)膜組織及功能的影響。方法 24只出生日齡14 d的豚鼠隨機分為頻閃組和對照組，每組均為12只。頻閃組使用頻閃調(diào)光器以0.5 Hz頻率等時交替頻閃，照度波動0～500 Lux；對照組給予500 Lux照明。2組均使用500 nm波長發(fā)光二極管，控制光照時間為晝夜12 h輪替。實驗第12周所有豚鼠行眼底彩色照相和閃光視網(wǎng)膜電圖（F-ERG）檢查。檢查結束后摘除眼球，測量眼球水平徑、垂直徑及前后徑3條徑線，光學顯微鏡和透射電子顯微鏡觀察眼球后極部結構改變。結果 與對照組比較，頻閃組豚鼠眼底漆裂紋樣改變更為明顯，ERG a波潛伏期延長；眼球水平徑、垂直徑及前后徑分別較對照組增加（0.89plusmn;0.30）、（0.69plusmn;0.20）、（0.96plusmn;0.30） mm，差異有統(tǒng)計學意義（t=12.7、11.9、15.8，P＜0.05）。光學顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，頻閃組豚鼠鞏膜纖維出現(xiàn)擴張；透射電子鏡顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，視網(wǎng)膜感光細胞層外段排列稀疏紊亂并可見大量脫落外節(jié)盤膜。結論 持續(xù)頻閃光刺激會誘導豚鼠眼球產(chǎn)生過度發(fā)育，并會影響視網(wǎng)膜結構與傳導功能。
目的 觀察藍光照射后大鼠視網(wǎng)膜中alpha;A和alpha;B晶體蛋白的表達。方法 40只雌性Wistar大鼠隨機分為正常對照組，藍光照射6、12、24 h組共4組，每組10只。正常對照組不給予任何處理，藍光照射6、12、24 h組分別給予藍光照射6、12、24 h后給予12 h暗適應，麻醉后摘取眼球。采用免疫組織化學和蛋白質(zhì)免疫印跡(Western blot)法檢測視網(wǎng)膜中alpha;A和alpha;B晶體蛋白表達。結果 免疫組織化學染色檢測顯示，正常對照組以及藍光照射6、12、24 h組視網(wǎng)膜alpha;A晶體蛋白吸光度［A，舊稱光密度（OD）］值分別為1.405 73plusmn;0.707 48、4.317 51plusmn;0.412 97、7.397 08plusmn;1.947 90、9.634 32plusmn;2.377 61，組間比較差異均有統(tǒng)計學意義（F=24.569，P＜0.001）。正常對照組以及藍光照射6、12、24 h組視網(wǎng)膜alpha;B晶體蛋白A值分別為0.129 36plusmn;0.033 93、0.507 17plusmn;0.117 55、7.345 43plusmn;2.292 97、4.042 26plusmn;3.890 23，組間比較差異均有統(tǒng)計學意義（F=40.102，P＜0.001）。Western blot 檢測發(fā)現(xiàn)，藍光照射6、12、24 h后視網(wǎng)膜alpha;A-及alpha;B-晶體蛋白表達明顯高于正常對照組。結論 藍光可誘導大鼠視網(wǎng)膜alpha;A-晶體蛋白和alpha;B-晶體蛋白表達上調(diào)。
目的 觀察670 nm近紅外光對SD大鼠的視網(wǎng)膜光損傷模型是否具有保護作用。方法 將32只SD大鼠分成8組，1組為正常對照組； 2組為紅外光對照組； 3、5、7組為光損傷組；第4、6、8組為光損傷加近紅外光保護組。光損傷劑量為900，1800，2700 lx白光，持續(xù)照射3 h；在光損傷前3 h和光損傷后0、24、48 h，保護組先后4次給予50 mW近紅外光照射30 min。光損傷后第5天將大鼠置于暗室過夜，第6天作視網(wǎng)膜電圖（ERG）檢測，并取眼球作病理檢查。結果 1組和2組視網(wǎng)膜細胞結構正常，外核層細胞約11層，ERG b波振幅（1088plusmn;55）mu;V。3組和4組900 lx白光持續(xù)照射3 h，未造成大鼠視網(wǎng)膜的損傷。5組1800 lx白光持續(xù)照射3 h，外核層細胞的減少至1～2層，內(nèi)節(jié)（IS）與外節(jié)（OS）結構完全消失；損傷范圍占全視網(wǎng)膜的0.48plusmn;0.12，損傷厚度占外核層全厚的L5=0.39plusmn;0.07，ERG的b波低伏（431plusmn;120 ）mu;V。6組在1800 Lux白光照射前后實施近紅外光保護，視網(wǎng)膜損傷范圍縮小為M6=0.17plusmn;0.12, （P5/6=0.002)；損失厚度減少到L6=0.22plusmn;0.09 (P5/6lt;0.01）；ERG b波振幅升高到（1011plusmn;83）mu;V（P5/6lt;0.001）。2700 lx白光持續(xù)照射3 h，7組和8組病理和ERG檢查的差異均無統(tǒng)計學意義［損傷面積:M7=0.83plusmn;0.09, M8=0.70plusmn;0.10, P7/8=0.074；損傷厚度L7=0.81plusmn;0.08, L8=0.73plusmn;0.08, P=0.17；ERG：H7=（234plusmn;26）mu;V，H8=（253plusmn;29）mu;V，P7/8gt;0.05］。結論 在一定的照射強度和時間范圍內(nèi)，670 nm近紅外光對大鼠視網(wǎng)膜光損傷有明確的保護作用。
目的 觀察視網(wǎng)膜色素上皮（RPE）細胞中黑色素含量與光感受器細胞功能之間的關系，探討黑色素對視網(wǎng)膜光損傷的作用。方法 老齡多巴色素異構酶敲除小鼠（Dct-/-小鼠）和C57BL/6小鼠（野生型小鼠）各20只，分別為Dct-/-小鼠組和野生型小鼠組。采用臨床電生理國際標準分別對各型鼠進行視網(wǎng)膜電圖（ERG）檢查，記錄其最大混合反應后各組隨機處死2只小鼠，摘除眼球作為陰性對照。余下每組各18只小鼠，將6只小鼠用20 W冷熒光燈行12 h明、12 h暗、12 h明的間斷光照36 h，連續(xù)3個循環(huán)。光照強度為（5000plusmn;356） lx。光照結束后第6天再次進行ERG檢查，記錄ERG結果。隨機頸椎脫臼法處死每組各2只小鼠，摘除眼球。所有摘除眼球常規(guī)組織切片，光學顯微鏡、電子顯微鏡觀察。結果 ERG檢查結果顯示，光損傷前后Dct-/-小鼠a、b波振幅明顯低于野生型小鼠（ta波光照前=-7.13，P＜0.01；tb波光照前=-4.414，P＜0.01；ta波光照后=-10.162，P＜0.01；tb波光照后=-6.772，P＜0.01）；光損傷后Dct-/-小鼠ERG a、b波的振幅下降幅度明顯高于野生型小鼠（ta波=4.975,P＜0.01；tb波=2.908,P＜0.01）。光損傷后，光學顯微鏡檢查可見Dct-/-小鼠視網(wǎng)膜水腫、變薄，較野生型明顯；電子顯微鏡檢查可見RPE細胞中黑色素顆粒融解、斷裂或丟失，光感受器細胞外節(jié)盤膜腫脹、碎裂及空泡變，Dct-/-小鼠損傷較野生型小鼠嚴重。結論 光損傷后RPE細胞黑色素含量減少，光感受器細胞功能下降，提示黑色素對光損傷可能有保護作用。
目的 探討藍光光照強度、時間與大鼠視網(wǎng)膜色素上皮（RPE）細胞復制衰老的關系。方法 將36只鼠齡12~14周的Wistar大鼠置于懸有波長為（450plusmn;10） nm的醫(yī)用藍光燈管的自制光照架中。隨機分為4組，每組9只大鼠，1組：無光照對照組；2組：自然光照組；3組：500 lx光照組；4組：1000 lx光照組。每組按照照射時間再分為1、2、3個月組3個亞組，分別在1、2、3個月時行10％水合氯醛腹腔注射麻醉后取出眼球，將右眼球行石蠟切片，蘇木精伊紅（HE）染色；左眼球行冰凍切片，采用衰老相關beta;半乳糖苷酶（SA-beta;-Gal）染色方法觀察RPE細胞染色陽性情況。采用SPSS 11.5統(tǒng)計軟件對結果數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析。結果 不同光照強度組、不同光照時間組大鼠RPE 細胞SA-beta;-Gal染色陽性細胞個數(shù)差異有統(tǒng)計學意義（F＝510.309，55.016；P＝0.000）；組間兩兩比較，除1組與2組之間差異無統(tǒng)計學意義外（P＝0.154），其它各組之間差異均有統(tǒng)計學意義（P＝0.000）。在單一光照強度條件下，除1組大鼠RPE細胞SA-beta;-Gal染色陽性細胞個數(shù)差異無統(tǒng)計學意義外（P=0.897）,其余各組差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）；在單一時間條件下，各組差異均有統(tǒng)計學意義（P＝0.000）。結論 同一藍光光照強度下，隨著時間的增加大鼠視網(wǎng)膜RPE細胞逐漸出現(xiàn)復制衰老改變;同一時間條件下，隨光照強度增加大鼠視網(wǎng)膜RPE細胞也逐漸出現(xiàn)復制衰老改變。
目的觀察芬戈莫德(FTY720)對視網(wǎng)膜光損傷大鼠光感受器細胞及小膠質(zhì)細胞的影響。 方法Sprague-Dawley大鼠120只隨機分為正常組、模型組、溶媒組和FTY720組, 每組30只。正常組大鼠不予處理; 模型組、溶媒組和FTY720組大鼠建立光損傷動物模型。模型組大鼠僅接受光照。FTY720組大鼠建模前腹腔注射FTY720, 溶媒組大鼠注射50%二甲基亞砜。光照后6 h及1、3、7 d, 采用流式細胞儀檢測大鼠小膠質(zhì)細胞所占比例; 酶聯(lián)免疫吸附試驗檢測大鼠視網(wǎng)膜中白細胞介素(IL)-1β的含量。光照后1 d, 采用原位末端標記法檢測光感受器細胞凋亡情況。光照后7 d, 采用蘇木精-伊紅染色觀察大鼠視網(wǎng)膜形態(tài)結構。 結果大鼠視網(wǎng)膜中小膠質(zhì)細胞所占比例及IL-1β含量均于光照后6 h開始升高, 光照后3 d達高峰, 光照后7 d開始下降。光照后6 h及1、3、7 d, FTY720組大鼠視網(wǎng)膜中小膠質(zhì)細胞所占比例及IL-1β含量較正常組升高, 較模型組、溶酶組明顯降低, 差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。光照后1 d, 正常組、模型組、溶酶組及FTY720組大鼠視網(wǎng)膜凋亡細胞比例分別為0、(87.66±2.50)%、(86.00±2.44)%、(49.66±2.80)%。FTY720組大鼠視網(wǎng)膜凋亡細胞比例較正常組升高, 較模型組、溶酶組明顯降低, 差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。光照后7 d, 正常組大鼠視網(wǎng)膜結構清晰, 細胞排列整齊; 溶酶組、模型組大鼠視網(wǎng)膜結構不清楚, 細胞排列紊亂, 外核層明顯變薄; FTY720組大鼠視網(wǎng)膜結構清晰, 外核層厚度較溶酶組、模型組厚, 但薄于正常組。 結論FTY720能抑制視網(wǎng)膜光損傷大鼠光感受器細胞的凋亡及小膠質(zhì)細胞的活化。
目的觀察絲氨酸蛋白酶HtrA1沉默對光損傷人視網(wǎng)膜色素上皮(RPE)細胞的影響。 方法體外培養(yǎng)人RPE細胞,取第8～12代生長良好的傳代細胞用于實驗。將細胞分為正常對照組、光損傷模型組。采用波長400 nm的藍色節(jié)能燈以(2000±500) Lux持續(xù)光照RPE細胞6 h建立光損傷模型。建模后光損傷模型組再分為針對HtrA1的小干擾RNA(HtrA1 siRNA)組、陰性對照組、空白對照組。應用脂質(zhì)體RNAimax將HtrA1 siRNA轉染至HtrA1 siRNA組細胞;陰性對照組細胞轉染非特異的陰性siRNA;空白對照組為單純光損傷細胞。采用細胞計數(shù)試劑盒、transwell小室法及流式細胞儀檢測各組細胞增生、遷徙、凋亡以及細胞周期情況;實時聚合酶鏈反應和蛋白免疫印跡法檢測細胞中HtrA1和血管內(nèi)皮生長因子A(VEGF-A)mRNA、蛋白質(zhì)表達。 結果光損傷模型組細胞中HtrA1 mRNA、蛋白表達均較正常對照組細胞明顯升高,差異有統(tǒng)計學意義(t=17.62、15.09,P<0.05)。與陰性對照組、空白對照組比較,HtrA1 siRNA組細胞增生(t=6.37、4.52)、遷徙能力(t=9.56、12.13)、凋亡率(t=23.37、29.08)明顯下降,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05);細胞停留在G0/G1期數(shù)目增多(t=6.24、4.93),差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05);HtrA1、VEGF-A mRNA(t=17.36、11.32、7.29、4.05)和蛋白(t=12.02、15.28、4.98、6.24)表達均明顯降低,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。 結論特異性沉默HtrA1基因表達可降低藍光對人RPE細胞增生、遷徙能力的損傷和細胞凋亡率;下調(diào)VEGF-A的表達。
目的觀察藍光誘導人視網(wǎng)膜色素上皮（RPE）細胞外泌體對核苷酸結合寡聚化結構樣受體蛋白（NLRP3）炎性體相關因子表達的影響。方法人RPE細胞株貼壁細胞分為實驗組和對照組。實驗組細胞以藍光照射6 h建立光損傷模型；對照組細胞常規(guī)培養(yǎng)。分級低溫超速離心法獲得兩組細胞外泌體，透射電子顯微鏡觀察其形態(tài)；蛋白免疫印跡法（Western blot）檢測兩組細胞外泌體表面CD63及白細胞介素（IL）-1β、IL-18、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶（caspase-1）蛋白相對表達水平。將兩組細胞外泌體作用于正常RPE細胞，據(jù)此分為藍光誘導細胞外泌體+實驗組、正常細胞外泌體+對照組。培養(yǎng)24 h后，Western blot檢測兩組細胞外泌體中IL-1β、IL-18、caspase-1蛋白表達；熒光實時定量聚合酶鏈反應檢測兩組細胞中NLRP3 mRNA表達。結果實驗組細胞發(fā)生損傷失去原有形態(tài)；外泌體均呈雙凹托盤狀，直徑50～200 nm；實驗組細胞外泌體中IL-1β（t=18.04）、IL-18（t=12.55）、caspase-1（t=14.70）蛋白表達量明顯高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.001）。藍光誘導細胞外泌體+實驗組細胞外泌體中IL-1β（t=18.59）、IL-18（t=23.95）、caspase-1（t=35.27）蛋白表達量明顯高于正常細胞外泌體+對照組，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.001）；藍光誘導細胞外泌體+實驗組、正常細胞外泌體+對照組細胞內(nèi)NLRP3 mRNA相對表達量分別為1.000±0.069、0.200±0.010，兩者比較，差異有統(tǒng)計學意義（t=12.20，P＜0.001）。結論藍光誘導RPE細胞外泌體可使RPE細胞內(nèi)NLRP3炎性體相關細胞因子IL-1β、IL-18、caspase-1蛋白和NLRP3 mRNA表達上調(diào)。