目的 比較羧甲基化葡聚糖（CMD）磁性納米顆粒與脂質(zhì)體LipofectamineTM 2000對人可溶性fms-樣酪氨酸激酶受體-1（sFlt-1）第2～4區(qū)基因片段的轉(zhuǎn)染率。方法 構(gòu)建真核表達質(zhì)粒編碼增強型綠色熒光蛋白質(zhì)粒（pcDNA3.1-EGFP）/sFlt-1（2～4），采用酶切、電泳及基因測序鑒定。將實驗分為磁顆粒組、脂質(zhì)體組和未轉(zhuǎn)染對照組進行。轉(zhuǎn)染后24、48 h，倒置相差熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞綠色熒光分布；流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞綠色熒光表達率；逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）法和免疫蛋白印跡（Western blot）法檢測sFlt-1(2～4)mRNA和蛋白表達；噻唑藍（MTT）比色法觀測細(xì)胞生長情況，計算各組細(xì)胞相對增長率（RGR）；Hoechst細(xì)胞核染色法觀察各組細(xì)胞凋亡情況。結(jié)果 重組質(zhì)粒pcDNA3.1/sFlt-1（2～4）酶切產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠電泳時出現(xiàn)大小為915 堿基對的條帶。流式細(xì)胞儀檢測發(fā)現(xiàn)，磁顆粒組平均轉(zhuǎn)染率為45％，脂質(zhì)體組平均轉(zhuǎn)染率21％；二者比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=2.541，P＜0.05）。RT-PCR和Western blot觀察發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染后48 h磁顆粒組細(xì)胞sFlt-1（2～4） mRNA和蛋白表達均明顯高于脂質(zhì)體組（t=2.454，2.398；P值均lt;0.05）。轉(zhuǎn)染后24、48 h，磁顆粒組RGR與未轉(zhuǎn)染對照組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（t=1.436，P＞0.05），脂質(zhì)體組RGR與未轉(zhuǎn)染對照組及磁顆粒組間差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（t=2.412，2.545，P值均lt;0.05）；磁顆粒組細(xì)胞凋亡率與未轉(zhuǎn)染對照組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（t=1.436，P＞0.05），與脂質(zhì)體組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=2.236，P＜0.05）。結(jié)論 CMD磁性顆粒較脂質(zhì)體LipofectamineTM 2000可獲得更高的sFlt-1(2～4) 基因片段轉(zhuǎn)染率。
目的 觀察可溶性fms-樣絡(luò)氨酸激酶受體-1（sFlt-1）基因胞外第2~3區(qū)和2~4區(qū)對缺氧、高糖環(huán)境下視網(wǎng)膜血管通透性及磷脂酰肌醇-3激酶/蛋白酶B（PI3K/Akt）之間信號通路的影響。方法 構(gòu)建真核表達質(zhì)粒編碼增強型綠色熒光蛋白質(zhì)粒（pcDNA3-1-EGFP）/sFlt-1（2~3）和pcDNA3-1-EGFP/sFlt-1（2~4），采用酶切、電泳及基因測序鑒定。將實驗分為正常對照組、缺氧組和高糖組進行。以羧甲基化葡聚糖（CMD）納米磁顆粒為基因載體，分別攜帶兩種重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染缺氧、高糖條件下培養(yǎng)的人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞（HUVEC）。采用分光光度計檢測各組兔視網(wǎng)膜血管對伊凡思藍（EB）染料的滲漏量。逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）和免疫蛋白印跡（Western blot）法分別檢測各組細(xì)胞PI3K/Akt信號通路下游特異性磷酸化激酶Akt（p-Akt）mRNA和蛋白的表達。結(jié)果 缺氧組和高糖組注射轉(zhuǎn)染細(xì)胞上清液后，視網(wǎng)膜血管EB滲漏量較正常對照組明顯增加（t=2.476，2.515；P值均lt;0.01）。缺氧組和高糖組轉(zhuǎn)染了pcDNA3-1-EGFP/sFlt-1(2~3)和pcDNA3-1-EGFP/sFlt-1(2~4)后，視網(wǎng)膜血管EB滲漏量較未轉(zhuǎn)染明顯降低（t=2.598，2.679，2.386，2.732；P值均lt;0.01）。缺氧組、高糖組HUVEC p-Akt mRNA表達較正常對照組明顯上調(diào)（t=2.612，2.545；P值均lt;0.01），轉(zhuǎn)染pcDNA3-1-EGFP/sFlt-1(2~3)和pcDNA3-1-EGFP/sFlt-1(2~4)后明顯下調(diào)（t=2.512，2.189，2.372，2.687；P值均lt;0.01）。缺氧組和高糖組HUVEC p-Akt蛋白表達較正常對照組明顯上調(diào)（t=2.376，2.712；P值均lt;0.01），轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-EGFP/sFlt-1(2~3)和pcDNA3-1-EGFP/sFlt-1(2~4)后明顯下調(diào)（t=2.259，2.391，2.399，2.413；P值均lt;0.01）。結(jié)論 sFlt-1受體胞外第2~3區(qū)和2~4區(qū)均可抑制缺氧、高糖環(huán)境下的視網(wǎng)膜血管通透性增高和PI3K/Akt通路的信號傳導(dǎo)。
目的 觀察可溶性fms-樣酪氨酸激酶受體-1(sFlt-1)不同基因片段對小鼠視網(wǎng)膜新生血管（RNV）的抑制作用。方法 構(gòu)建攜帶sFlt-1（2~3）、（2~4）免疫球蛋白樣區(qū)域編碼基因的重組慢病毒sFlt-1（2~3）和sFlt-1（2~4）。鼠齡7 d 的C57/6J小鼠96只，數(shù)字表法隨機分為4組，每組24只。1組為正常對照組；2組為模型對照組；3組為sFlt-1（2~3）組；4組為sFlt-1（2~4）組。2、3、4組置于(75plusmn;2)%氧濃度環(huán)境，出生后12 d再置于正?？諝庀嘛曫B(yǎng)，并分別玻璃體腔注射空病毒、慢病毒sFlt-1(2~3)和sFlt-1(2~4)各1 mu;l。出生后17 d，熒光素灌注造影行視網(wǎng)膜鋪片，觀察視網(wǎng)膜血管改變；視網(wǎng)膜切片行蘇木精－伊紅染色，計數(shù)小鼠RNV細(xì)胞核數(shù)；蛋白質(zhì)免疫印跡法(Western blot)檢測視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)和VEGF受體-2含激酶插入?yún)^(qū)受體/胎肝激酶-1(KDR/Flk-1)的蛋白表達。結(jié)果 出生后17 d，與2組比較，3、4組視網(wǎng)膜熒光滲漏面積、RNV、突破內(nèi)界膜(ILM)的血管內(nèi)皮細(xì)胞核數(shù)均明顯減少(P＜0.01)；VEGF蛋白表達無明顯變化(P＞0.05)，KDR/Flk-1蛋白表達明顯下降(P＜0.01)。結(jié)論 sFlt-1(2~3)和sFlt-1(2~4)基因片段能明顯抑制氧誘導(dǎo)小鼠RNV的形成，sFlt-1（2~3）效果更為顯著。