目的 研究角蛋白17（keratin 17，K-17）對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞遷移、增殖和管樣結(jié)構(gòu)形成的影響，了解K-17 在血管生成過(guò)程中的作用。 方法 將人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（human umbilical vein endothelial cell，HUVEC）于含10%FBS 的DMEM 培養(yǎng)液培養(yǎng)過(guò)夜，采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法向HUVEC 中分別加入K-17- 小分子干擾RNA（small interferingRNA，siRNA）- 轉(zhuǎn)染試劑（Lipofectamine 2000）混合液（實(shí)驗(yàn)組）、siRNA- 轉(zhuǎn)染試劑混合液（陰性對(duì)照組），使siRNA 終濃度為50 nmol/L；對(duì)照組加相同體積僅含載體（脂質(zhì)體Lipofectamine 2000）的培養(yǎng)基，采用RT-PCR 和Western blot 法檢測(cè)K-17-siRNA 沉默效果。于培養(yǎng)后36 h 采用細(xì)胞計(jì)數(shù)法檢測(cè)細(xì)胞增殖能力；培養(yǎng)后30 h，分別采用24 孔板Millicell小室檢測(cè)細(xì)胞遷移能力以及膠原纖維凝膠實(shí)驗(yàn)法檢測(cè)細(xì)胞分化成管能力。另取未經(jīng)siRNA 處理的HUVEC 分別在含10%FBS 的培養(yǎng)基（A 組）、含2%FBS 的培養(yǎng)基（B 組）和含2%FBS 及10 ng/mL bFGF 的培養(yǎng)基（C 組）中培養(yǎng)24 h，檢測(cè)HUVEC K-17 的表達(dá)。 結(jié)果 實(shí)驗(yàn)組K-17-siRNA 作用于HUVEC 30 h 后，RT-PCR 檢測(cè)示細(xì)胞內(nèi)K-17 mRNA 的表達(dá)為0.09 ± 0.01，較陰性對(duì)照組0.35 ± 0.07 和對(duì)照組0.34 ± 0.06 均降低了約74%（P lt; 0.01）；Western blot 檢測(cè)示實(shí)驗(yàn)組K-17-siRNA 作用于HUVEC 30 h 后，細(xì)胞內(nèi)K-17 蛋白表達(dá)為0.19 ± 0.01，較陰性對(duì)照組0.52 ± 0.01 和對(duì)照組0.55 ± 0.02分別降低了63% 和65%（P lt; 0.01）；陰性對(duì)照組和對(duì)照組間比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P gt; 0.05）。K-17-siRNA 作用HUVEC 36 h 后，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞增殖能力與陰性對(duì)照組和對(duì)照組比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P gt; 0.05）。HUVEC 轉(zhuǎn)染K-17-siRNA 30 h 后，實(shí)驗(yàn)組HUVEC 24 h 穿過(guò)Millicell 小室上室膜進(jìn)入下室的細(xì)胞數(shù)為（3 719.0 ± 319.0）個(gè)，明顯低于陰性對(duì)照組（7 356.3 ± 795.7）個(gè)和對(duì)照組（7 437.5 ± 212.0）個(gè)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P lt; 0.01），陰性對(duì)照組和對(duì)照組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P gt; 0.05）。實(shí)驗(yàn)組、陰性對(duì)照組和對(duì)照組HUVEC 24 h 分化形成的管數(shù)分別為（1.1 ± 0.5）、（3.6 ± 0.5）和（3.2 ±0.6）管/ 視野，實(shí)驗(yàn)組與陰性對(duì)照組、對(duì)照組間比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P lt; 0.01），陰性對(duì)照組和對(duì)照組間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P gt; 0.05）。A、B、C 組HUVEC K-17 的表達(dá)分別為0.25 ± 0.02、0.08 ± 0.01 和0.72 ± 0.03，3 組間比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P lt; 0.01）。 結(jié)論 K-17 對(duì)HUVEC 增殖無(wú)影響，但增強(qiáng)其遷移能力，有利于血管生成。
【摘 要】 目的 應(yīng)用不同來(lái)源的成肌細(xì)胞（myoblast，Mb）研究肌球蛋白輕鏈（myosin light chain，Myl）在肌肉再生中的作用，為進(jìn)一步了解Myl 的生理功能提供依據(jù)。 方法 3 周齡健康雄性C57BL/6 小鼠12 只。采用酶消化法和Preplate 技術(shù)分離純化小鼠眼外肌、膈肌和腓腸肌Mb（eMb、dMb 和gMb），進(jìn)行傳代培養(yǎng)。采用RT-PCR 和Western blot法檢測(cè)第1 代細(xì)胞Myl 的表達(dá)，亞甲基藍(lán)法檢測(cè)細(xì)胞增殖能力，倒置相差顯微鏡觀察肌管形成情況。采用濃度為1、2、4、8、16 ng/mL Myl 單克隆抗體分別處理3 種細(xì)胞（實(shí)驗(yàn)組），與未處理的細(xì)胞比較（對(duì)照組），觀察細(xì)胞增殖能力及肌管形成的變化。 結(jié)果 培養(yǎng)24 h 的eMb、dMb 和gMb 均檢測(cè)到Myl1、Myl4 mRNA 和Myl 蛋白表達(dá)，且eMb 的表達(dá)水平顯著低于dMb 和gMb（P lt; 0.01），dMb 和gMb 間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P gt; 0.05） ；3 種細(xì)胞均未檢測(cè)到Myl2 和 Myl3 mRNA 表達(dá)。eMb 的增殖速度高于dMb 和gMb（P lt; 0.01）；eMb 和dMb、gMb 分別在接種后40 h 和16 h 出現(xiàn)肌管；第6 天eMb 肌管數(shù)為（137.2 ± 24.5）/ 視野，顯著高于dMb 的（47.6 ± 15.5）/ 視野和gMb 的（39.8 ± 5.1）/ 視野（P lt; 0.01），后兩者差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P gt; 0.05）。Myl 抗體作用后，3 種細(xì)胞實(shí)驗(yàn)組各濃度吸光度值均顯著高于對(duì)照組（P lt; 0.05），表現(xiàn)濃度依賴性；dMb 實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組16 h 肌管數(shù)分別為（48.2 ± 7.1）/ 孔和（23.4 ± 4.9）/ 孔，6 d 肌管數(shù)分別為（40.6 ± 10.2）/ 視野和（63.1 ±6.1）/ 視野，兩組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P lt; 0.01）。 結(jié) 論 Myl 可能通過(guò)促使Mb 終末分化，負(fù)性影響Mb 增殖而在肌肉再生中發(fā)揮一定作用。