目的 構(gòu)建nesprin蛋白siRNA慢病毒載體（LV-siNesprin），感染骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（MSCs），觀察nesprin蛋白對MSCs的影響?！》椒ā♂槍esprin靶基因序列設(shè)計并合成4對miRNA oligo，并將4對oligo退火成雙鏈DNA，測序鑒定。將4種miRNA干擾質(zhì)粒（SR-1、SR-2、SR-3、SR-4）轉(zhuǎn)入大鼠血管平滑肌細(xì)胞，用反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-PCR）和蛋白印跡法（Western blotting）檢測干擾效應(yīng)，篩選最佳干擾序列；將最佳干擾序列和pDONR221載體進(jìn)行重組反應(yīng)，獲得含干擾序列的入門載體，再將入門載體和慢病毒表達(dá)的目的載體pLenti6/V5-DEST進(jìn)行重組反應(yīng)獲得含干擾序列的LV-siNesprin＋綠色熒光蛋白（GFP），包裝慢病毒，測定病毒滴度。LV-siNesprin＋GFP轉(zhuǎn)染MSCs，Western blotting鑒定比較nesprin蛋白表達(dá)情況（分為LV-siNesprin＋GFP組、GFP對照組和正常細(xì)胞組），用4，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）染色觀察細(xì)胞核形態(tài)改變和四甲基偶氮唑鹽（MTT）法檢測MSCs感染LV-siNesprin后24 h、48 h、72 h和96 h的增殖情況（分為LV-siNesprin＋GFP組、GFP對照組和正常細(xì)胞組）?！〗Y(jié)果 測序證實(shí)合成的4對miRNA oligo正確，RT-PCR和Western blotting篩選出最佳干擾miRNA質(zhì)粒SR-3，成功構(gòu)建LV-siNesprin，包裝慢病毒，病毒懸液的活性滴度為1×106 ifu/ml。LV-siNesprin轉(zhuǎn)染MSCs后，nesprin蛋白表達(dá)明顯下降，出現(xiàn)細(xì)胞核融合、核碎裂等形態(tài)學(xué)改變；MTT法檢測顯示，LV-siNesprin＋GFP組MSCs增殖速度較GFP對照組和正常細(xì)胞組減慢?！〗Y(jié)論 Nesprin蛋白對MSCs核膜穩(wěn)定維持核膜空間結(jié)構(gòu)起作用，并利于細(xì)胞增殖更新。
目的構(gòu)建 BMP-2基因重組慢病毒載體，并檢測其轉(zhuǎn)染豬BMSCs 后BMP-2表達(dá)活性及誘導(dǎo)BMSCs成骨分化情況，為進(jìn)一步構(gòu)建組織工程骨軟骨奠定基礎(chǔ)。 方法取2只2月齡巴馬香豬（體重約15 kg）髂骨骨髓，采用密度梯度離心法分離培養(yǎng)BMSCs，并傳代。利用基因重組技術(shù)構(gòu)建 BMP-2基因重組慢病毒載體，并以感染復(fù)數(shù)（multiplicity of infection，MOI）10、25、50、100、200轉(zhuǎn)染第2代BMSCs，通過熒光顯微鏡及倒置相差顯微鏡觀察確定最佳MOI值。以最佳 MOI 值感染 BMSCs作為實(shí)驗組，空載體轉(zhuǎn)染的 BMSCs（空載體組）及未轉(zhuǎn)染的 BMSCs（空白組）作為對照，通過 RT-PCR、免疫組織化學(xué)染色、Western blot檢測 BMP-2 mRNA及蛋白在 BMSCs 中的表達(dá)，并應(yīng)用ALP染色、ALP活性檢測及茜素紅鈣結(jié)節(jié)染色檢測其成骨分化情況。 結(jié)果經(jīng)RT-PCR基因測序鑒定 BMP-2基因重組慢病毒載體構(gòu)建成功，轉(zhuǎn)染 BMSCs后熒光顯微鏡下可見綠色熒光表達(dá)，且MOI值為 100 時為最佳表達(dá)。RT-PCR 提示 BMP-2 基因成功轉(zhuǎn)染至 BMSCs 中；免疫組織化學(xué)染色及 Western blot檢測示轉(zhuǎn)染后BMSCs并可持續(xù)、穩(wěn)定、高效表達(dá) BMP-2蛋白；培養(yǎng)后2周BMSCs可見ALP表達(dá)及鈣結(jié)節(jié)形成。 結(jié)論成功構(gòu)建 BMP-2基因重組慢病毒載體并轉(zhuǎn)染豬 BMSCs，BMP-2 基因轉(zhuǎn)染入 BMSCs 后能持續(xù)、穩(wěn)定、高效表達(dá) BMP-2 基因和蛋白，并成功誘導(dǎo) BMSCs 向成骨細(xì)胞分 化。
目的探討重組慢病毒（lentivirus，LVs）介導(dǎo)超極化激活的環(huán)核苷酸門控陽離子通道4（hyperpo-larization-activated cyclic nucleotide-gated cation channel 4，HCN4）基因轉(zhuǎn)染大鼠BMSCs構(gòu)建生物起搏細(xì)胞的可行性。 方法選取3～5周齡SD大鼠，采用改良全骨髓貼壁培養(yǎng)法分離培養(yǎng)BMSCs。以LVs作為轉(zhuǎn)染載體，增強(qiáng)綠色熒光蛋白（enhanced green fluorescent protein，EGFP）為標(biāo)記，構(gòu)建LVs-HCN4-EGFP病毒液。取第3代BMSCs分別轉(zhuǎn)染LVs-HCN4-EGFP病毒液（實(shí)驗組）和LVs-EGFP空白病毒液（對照組），熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染24、48、72 h后兩組綠色熒光表達(dá)情況，72 h時Western blot檢測HCN4蛋白表達(dá)；電生理檢測實(shí)驗組轉(zhuǎn)染72 h后BMSCs的起搏電流。 結(jié)果實(shí)驗組BMSCs 形態(tài)正常、生長良好；48 h后熒光顯微鏡下可見散在的綠色熒光，轉(zhuǎn)染效率約10%；72 h熒光表達(dá)稍增多，轉(zhuǎn)染效率為20%～25%。對照組未見綠色熒光表達(dá)。Western blot檢測示轉(zhuǎn)染72 h后，實(shí)驗組可見與HCN4蛋白相對分子質(zhì)量相同的條帶表達(dá)，而對照組僅有微弱表達(dá)；實(shí)驗組蛋白條帶灰度值為33.75 ± 0.41，顯著高于對照組的23.39 ± 0.33（t=17.524，P=0.013）。實(shí)驗組轉(zhuǎn)染后的BMSCs檢測到起搏電流，并能被CsCl完全阻斷，符合起搏電流特點(diǎn)。結(jié)論重組LVs介導(dǎo)HCN4基因成功轉(zhuǎn)染大鼠BMSCs，并檢測到HCN4蛋白表達(dá)及起搏電流。
目的構(gòu)建插頭/翼狀螺旋轉(zhuǎn)錄因子C2（homo sapiens forkhead box C2，F(xiàn)oxc2）基因慢病毒載體并轉(zhuǎn)染兔BMSCs，檢測其在BMSCs中的表達(dá)，為進(jìn)一步應(yīng)用攜帶Foxc2基因的BMSCs移植治療股骨頭缺血性壞死奠定實(shí)驗基礎(chǔ)。 方法通過RT-PCR法獲得人Foxc2基因片段，將該片段克隆至包含綠色熒光蛋白（green fluorescent protein，GFP）的慢病毒載體LV-GFP中，重組獲得Foxc2慢病毒質(zhì)粒，將其與pGC-LV載體、pHelper1.0載體、pHelper2.0載體共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，獲得Foxc2基因慢病毒載體；檢測病毒滴度。分離、培養(yǎng)兔BMSCs，以Foxc2基因慢病毒載體轉(zhuǎn)染第3 代BMSCs，通過熒光表達(dá)法判定最佳感染復(fù)數(shù)（multiplicity of infection，MOI），并以最佳MOI進(jìn)行轉(zhuǎn)染，倒置熒光顯微鏡觀察、Western blot法檢測轉(zhuǎn)染1、3、7 d BMSCs中Foxc2的表達(dá)；對轉(zhuǎn)染后BMSCs行成骨誘導(dǎo)，茜素紅染色法觀察礦化物結(jié)節(jié)形成情況。 結(jié)果成功構(gòu)建Foxc2基因慢病毒載體，經(jīng)酶切及測序鑒定完全正確，能轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞并表達(dá)GFP，病毒滴度為2 × 108 TU/mL。Foxc2基因慢病毒轉(zhuǎn)染BMSCs的最佳MOI為200，轉(zhuǎn)染BMSCs 3 d后經(jīng)免疫熒光檢測84.5% ± 4.8%的BMSCs可表達(dá)Foxc2。Western blot 結(jié)果顯示Foxc2在BMSCs中高表達(dá)，且在7 d內(nèi)表達(dá)水平逐漸升高。成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)2周后，茜素紅染色示細(xì)胞質(zhì)中有大量紅色的鈣化基質(zhì)沉積。 結(jié)論成功構(gòu)建并包裝獲得較高滴度的Foxc2基因慢病毒載體，慢病毒可高效并穩(wěn)定轉(zhuǎn)染BMSCs，F(xiàn)oxc2表達(dá)增加，為基因治療股骨頭缺血性壞死奠定了基礎(chǔ)。
【摘 要】 目的 構(gòu)建NEP1-40（Nogo extra cellular peptide residues 1-40）基因慢病毒表達(dá)載體，為后續(xù)轉(zhuǎn)染目的細(xì)胞奠定基礎(chǔ)，并實(shí)現(xiàn)在細(xì)胞中高效、穩(wěn)定表達(dá)。 方法 從含有 NEP1-40 基因的 cDNA 文庫中，利用PCR 方法釣取NEP1-40 基因編碼區(qū)片段。將目的基因與酶切線性化的載體pGC-FU 進(jìn)行定向連接，其產(chǎn)物轉(zhuǎn)化細(xì)菌感受態(tài)細(xì)胞。對長出的克隆先進(jìn)行菌落PCR 鑒定，再對PCR 鑒定陽性的克隆進(jìn)行測序和比對分析，比對正確的克隆即為構(gòu)建成功的目的質(zhì)粒。將構(gòu)建成功的目的質(zhì)粒和兩種輔助包裝質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T 細(xì)胞，包裝成慢病毒，熒光顯微鏡下觀察慢病毒轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞后熒光表達(dá)情況，采用Western blot 檢測NEP1-40 及綠色熒光蛋白融合蛋白表達(dá)情況。 結(jié)果 PCR 產(chǎn)物經(jīng)電泳分析表明成功獲取NEP1-40 基因cDNA 克隆，測序提示慢病毒轉(zhuǎn)染質(zhì)粒連接構(gòu)建正確；熒光表達(dá)檢測顯示293T 細(xì)胞中產(chǎn)生慢病毒顆粒；Western blot 顯示NEP1-40 在細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定表達(dá)。 結(jié)論 成功構(gòu)建NEP1-40 基因慢病毒表達(dá)載體，為后續(xù)轉(zhuǎn)染目的細(xì)胞后從分子水平探討NEP1-40 基因功能奠定了實(shí)驗基礎(chǔ)。
目的 構(gòu)建人microRNA-210（miR-210）慢病毒重組載體并轉(zhuǎn)染人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞株（human umbilical vein endothelial cells 12，HUVE-12），探討其過表達(dá)對HUVE-12 成血管的影響，為研究血管再生機(jī)制提供實(shí)驗?zāi)Ｐ?。方?構(gòu)建pGCSIL-GFP-pre-miR-210 重組質(zhì)粒表達(dá)載體并轉(zhuǎn)染HUVE-12，熒光顯微鏡觀察GFP 陽性表達(dá)細(xì)胞數(shù)及實(shí)時熒光定量PCR 法檢測miR-210 表達(dá)變化；細(xì)胞分為空病毒對照組（LV-GFP 對照組）和miR-210 轉(zhuǎn)染組（LV-miR-210-GFP 組），流式細(xì)胞儀檢測各組細(xì)胞ephrinA3 表達(dá)變化；ELISA 檢測細(xì)胞培養(yǎng)上清中VEGF 含量；將兩組細(xì)胞分別接種于Matrigel 觀察血管形成能力。 結(jié)果 重組載體經(jīng)酶切、測序鑒定正確，GFP 表達(dá)強(qiáng)度在轉(zhuǎn)染后48 ～ 72 h 達(dá)峰值；實(shí)時熒光定量PCR 檢測結(jié)果顯示：LV-miR-210-GFP 組miR-210 表達(dá)水平較LV-GFP 對照組增加9.72 倍（t= —11.10，P=0.00）。流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果顯示LV-miR-210-GFP 組ephrinA3 陽性細(xì)胞率為12.52% ± 0.67%，明顯較LV-GFP 對照組（73.22% ± 1.45%）降低（t= —66.12，P=0.00）；ELISA 檢測結(jié)果顯示LV-miR-210-GFP 組細(xì)胞上清中VEGF 含量顯著高于LV--GFP 對照組（[ 305.29 ± 16.52）pg/mL vs.（42.52 ± 3.11）pg/mL]（t= —27.06，P=0.00）；血管形成能力實(shí)驗顯示LV-miR-210-GFP 組毛細(xì)血管管腔數(shù)為17.33 ± 6.33，較LV-GFP 對照組（6.33 ± 2.33）顯著增加（t= —2.83，P=0.04）。 結(jié)論 成功構(gòu)建miR-210 慢病毒重組載體，并能在HUVE-12 中穩(wěn)定表達(dá)，過表達(dá)miR-210 能明顯增強(qiáng)HUVE-12 血管形成能力，為進(jìn)一步研究miR-210 調(diào)控血管新生的分子機(jī)制奠定了實(shí)驗基礎(chǔ)。
目的 構(gòu)建豬TGF-β1 重組慢病毒表達(dá)載體，并轉(zhuǎn)染BMSCs，為構(gòu)建組織工程骨軟骨提供TGF-β1 修飾的BMSCs，作為持續(xù)、高效的種子細(xì)胞。 方法 將已獲取的目的基因TGF-β1 cDNA 包裝至慢病毒載體中，通過PCR及基因測序?qū)﹃栃钥寺∵M(jìn)行鑒定，并測定病毒滴度。取2 月齡巴馬香豬（體重約15 kg）骨髓制備BMSCs，取第2 ～ 3代用于實(shí)驗。用TGF-β1 重組慢病毒載體以感染復(fù)數(shù)（multiplicity of infection， MOI）為10、50、70、100、150 分別轉(zhuǎn)染BMSCs，通過激光共聚焦顯微鏡觀察，并以Western blot 檢測不同MOI 值的轉(zhuǎn)染效果，確定最佳MOI 值。用TGF-β1 重組慢病毒載體以最佳MOI 值感染BMSCs 作為實(shí)驗組，以空載體轉(zhuǎn)染的BMSCs（空載體組）及未轉(zhuǎn)染的BMSCs（空白組）作為對照，通過RT-PCR、免疫細(xì)胞化學(xué)染色、ELISA 等方法檢測TGF-β1 基因及蛋白在BMSCs 中的表達(dá)情況，并檢測Ⅱ型膠原表達(dá)情況。 結(jié)果 經(jīng)PCR 及基因測序鑒定TGF-β1 重組慢病毒表達(dá)載體構(gòu)建成功，并成功轉(zhuǎn)染BMSCs，激光共聚焦顯微鏡下可觀察到強(qiáng)綠色熒光；Western blot 示MOI 為70 時轉(zhuǎn)染效果最佳；RT-PCR 示實(shí)驗組TGF-β1 基因的表達(dá)量明顯高于空載體組及空白組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P lt; 0.05）；免疫細(xì)胞化學(xué)染色示實(shí)驗組TGF-β1 蛋白及Ⅱ型膠原呈陽性表達(dá)，而空載體組及空白組呈弱陽性或陰性表達(dá)；ELISA 示實(shí)驗組TGF-β1 蛋白至轉(zhuǎn)染后21 d 仍有較高表達(dá)。 結(jié)論 TGF-β1 重組慢病毒表達(dá)載體可成功轉(zhuǎn)染BMSCs，TGF-β1 蛋白可長期、穩(wěn)定表達(dá)，促使BMSCs 向成軟骨細(xì)胞方向分化。
目的 構(gòu)建可誘導(dǎo)表達(dá)hBMP-2 的慢病毒載體，并研究hBMP-2 在人臍血間充質(zhì)干細(xì)胞（human umbilical cord blood mesenchymal stem cells，HUMSCs）中的可誘導(dǎo)性表達(dá)。 方法 以pcDNA-hBMP-2 為模板，通過PCR 反應(yīng)獲取hBMP-2，運(yùn)用GATEWAY 技術(shù)構(gòu)建pLV/EXPN2-Neo-TRE-hBMP-2、pLV/EXPN2-Puro-EF1A- 反向反式激活因子（reverse transactivator，rtTA），通過PCR 鑒定重組慢病毒載體構(gòu)建。將重組慢病毒與輔助質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)染293FT 細(xì)胞，包裝成能表達(dá)hBMP-2 的可控性慢病毒，并測定病毒滴度。用病毒轉(zhuǎn)染HUMSCs，使用強(qiáng)力霉素進(jìn)行誘導(dǎo)，分別在相同誘導(dǎo)時間（48 h）不同誘導(dǎo)濃度（0、10、100 ng/mL，1、10、100 μg/mL）及不同誘導(dǎo)時間（12、24、48、72 h）相同誘導(dǎo)濃度（10 μg/mL）兩種情況下用ELISA 法測定hBMP-2 的表達(dá)情況。對轉(zhuǎn)染前后的HUMSCs 進(jìn)行成骨誘導(dǎo)，用茜素紅染色法觀察礦化物結(jié)節(jié)形成情況。 結(jié)果 成功構(gòu)建了攜帶hBMP-2 的可控性慢病毒載體pLV/EXPN2-Neo-TRE-hBMP-2、pLV/EXPN2-Puro-EF1A-rtTA，并獲得相應(yīng)的病毒，病毒滴度分別為3.5 × 108 TU/mL 和9.5 × 107 TU/mL；病毒轉(zhuǎn)染HUMSCs 后，HUMSCs 可通過強(qiáng)力霉素的誘導(dǎo)可控性表達(dá)hBMP-2。在相同誘導(dǎo)時間情況下，強(qiáng)力霉素10 μg/mL 時誘導(dǎo)表達(dá)最強(qiáng)；而在相同誘導(dǎo)濃度下，hBMP-2 的表達(dá)在誘導(dǎo)48 h 達(dá)峰值。HUMSCs 成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)2 周后，茜素紅染色示胞漿中有大量紅色的鈣化基質(zhì)沉積。 結(jié)論 通過GATEWAY 技術(shù)可以建立攜帶hBMP-2 目的基因的可控性慢病毒載體，為進(jìn)一步研究hBMP-2 誘導(dǎo)HUMSCs 成骨分化治療骨壞死模型奠定實(shí)驗基礎(chǔ)，并提供了一種新的實(shí)驗思路。
目的 構(gòu)建共表達(dá)增強(qiáng)型綠色熒光蛋白（enhanced green fluorescent protein，EGFP）基因和人胰島素（insulin）基因的慢病毒載體，探討其對人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞（human umbilical cord mesenchymal stem cells，hUCMSCs）的轉(zhuǎn)染情況，為今后組織工程脂肪構(gòu)建與體內(nèi)回植研究奠定基礎(chǔ)。 方法 采用DNA 重組技術(shù)，將insulin 基因克隆至帶EGFP 的慢病毒表達(dá)載體pLenti6.3- 內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)序列（internal ribosome entry site，IRES）-EGFP 中，篩選陽性克隆，并用脂質(zhì)體介導(dǎo)法將慢病毒包裝系統(tǒng)和帶目的基因的質(zhì)粒pLenti6.3-insulin-IRES-EGFP 共同轉(zhuǎn)染到293T 細(xì)胞內(nèi)包裝病毒，熒光倒置相差顯微鏡觀察包裝細(xì)胞報告基因的表達(dá)情況。收集病毒上清，純化濃縮，測定重組病毒的滴度。取足月兒臍帶以組織塊培養(yǎng)法分離培養(yǎng)hUCMSCs，以不同感染復(fù)數(shù)（multiple of infection，MOI，分別為0、1、3、5、7、10、15、20）的重組慢病毒感染hUCMSCs，通過報告基因綠色熒光蛋白的表達(dá)篩選最適MOI；以最適MOI 重組慢病毒感染hUCMSCs，應(yīng)用實(shí)時熒光定量PCR 及Western blot 法分別檢測細(xì)胞中insulin 基因及insulin 蛋白水平的表達(dá)情況。 結(jié)果 成功構(gòu)建了共表達(dá)insulin 基因和EGFP 基因的重組慢病毒載體pLenti6.3-insulin-IRES-EGFP，并對其成功包裝、純化及濃縮，病毒滴度為1.3 × 108 TU/mL。不同MOI 的重組慢病毒感染hUCMSCs 后，通過綠色熒光蛋白表達(dá)的陽性細(xì)胞數(shù)篩選其最適MOI 為10，此時對細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率可達(dá)到90%。實(shí)時熒光定量PCR 檢測示轉(zhuǎn)染組insulin mRNA 表達(dá)陽性，未轉(zhuǎn)染組為陰性；Western blot 檢測示轉(zhuǎn)染組細(xì)胞內(nèi)及上清液insulin 蛋白表達(dá)陽性，未轉(zhuǎn)染組均為陰性。 結(jié)論 構(gòu)建的攜帶insulin基因的重組慢病毒載體pLenti6.3-insulin-IRES-EGFP 可有效轉(zhuǎn)染hUCMSCs，表達(dá)insulin 蛋白。
目的 構(gòu)建攜帶人肝細(xì)胞生長因子（human hepatocyte growth factor，hHGF）基因的慢病毒，感染大鼠BMSCs，建立穩(wěn)定表達(dá)hHGF 的BMSCs/hHGF 細(xì)胞。 方法 從含hHGF 基因的質(zhì)粒pcDNA-hHGF 中，用PCR 法獲取hHGF 全長基因，與慢病毒載體pGC-E1 分別進(jìn)行Age Ⅰ酶切，產(chǎn)物定向連接，轉(zhuǎn)化后行PCR 鑒定和測序，構(gòu)建hHGF 慢病毒表達(dá)質(zhì)粒。脂質(zhì)體Lipofectamine 2000 介導(dǎo)慢病毒載體三質(zhì)粒pGC-E1-hHGF、pHelper 1.0、pHelper 2.0 共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞。收集病毒超濾離心濃縮，實(shí)時定量PCR 測定滴度。將hHGF 慢病毒感染BMSCs，熒光顯微鏡觀察熒光表達(dá)，確定最佳感染復(fù)數(shù)（multiplicities of infection，MOI）值，以最佳MOI 值感染細(xì)胞，流式細(xì)胞儀檢測感染效率，ELISA 法檢測細(xì)胞培養(yǎng)上清hHGF 分泌水平，RT-PCR 檢測hHGF 基因的表達(dá)。 結(jié)果 實(shí)驗成功構(gòu)建攜帶hHGF 基因的慢病毒，滴度達(dá)1 × 108 TU/mL。hHGF 慢病毒高效率感染BMSCs，最佳MOI 值為10。流式細(xì)胞儀檢測感染效率達(dá)98%，且在感染后28 d BMSCs 仍穩(wěn)定表達(dá)強(qiáng)烈的綠色熒光。細(xì)胞培養(yǎng)上清可檢測到hHGF 因子，術(shù)后5 d 達(dá)高峰，達(dá)40.5 ng/mL，這種高水平分泌可持續(xù)至感染后28 d。RT-PCR 檢測出hHGF 基因的表達(dá)。 結(jié)論 通過慢病毒載體將hHGF 基因穩(wěn)定感染至BMSCs 細(xì)胞，可獲得長期穩(wěn)定的表達(dá)，并持續(xù)分泌hHGF 因子。