目的探討富白細(xì)胞和血小板血漿（leucocyte- and platelet-rich plasma,L-PRP）在治療早期股骨頭缺血性壞死（avascular necrosis of femoral head，ANFH）兔模型中，對BMSCs成骨分化作用的影響。 方法取4～6月齡新西蘭大白兔24只，體重2.0～3.0 kg，雌雄不拘。隨機(jī)分成A、B、C、D 4組（n=6），建立雙側(cè)ANFH模型。取髂骨骨髓分離培養(yǎng)BMSCs并鑒定；采用Landesberg方法制備L-PRP。ANFH動物模型修復(fù)方法：A組單純行髓芯減壓，B組行髓芯減壓聯(lián)合L-PRP移植，C組行髓芯減壓聯(lián)合BMSCs移植，D組行髓芯減壓聯(lián)合BMSCs及L-PRP移植。術(shù)后2、4、8周攝X線片，觀察髖關(guān)節(jié)和骨缺損灶骨密度變化，并行Lane-Sandhu X線評分評價成骨情況；取各組股骨頭標(biāo)本，行組織學(xué)觀察及血管計數(shù)、新生骨面積百分比檢測。 結(jié)果影像學(xué)及組織學(xué)觀察均顯示各組骨缺損呈現(xiàn)不同程度骨再生。術(shù)后2、4、8周，Lane-Sandhu X線片評分、血管計數(shù)、新生骨面積百分比均顯示：C、D組明顯優(yōu)于A、B組，D組優(yōu)于C組，B組優(yōu)于A組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。 結(jié)論L-PRP在治療兔ANFH模型中對BMSCs成骨分化有促進(jìn)作用，為臨床髓芯減壓聯(lián)合BMSCs及L-PRP治療ANFH奠定了理論基礎(chǔ)。
目的構(gòu)建 BMP-2基因重組慢病毒載體，并檢測其轉(zhuǎn)染豬BMSCs 后BMP-2表達(dá)活性及誘導(dǎo)BMSCs成骨分化情況，為進(jìn)一步構(gòu)建組織工程骨軟骨奠定基礎(chǔ)。 方法取2只2月齡巴馬香豬（體重約15 kg）髂骨骨髓，采用密度梯度離心法分離培養(yǎng)BMSCs，并傳代。利用基因重組技術(shù)構(gòu)建 BMP-2基因重組慢病毒載體，并以感染復(fù)數(shù)（multiplicity of infection，MOI）10、25、50、100、200轉(zhuǎn)染第2代BMSCs，通過熒光顯微鏡及倒置相差顯微鏡觀察確定最佳MOI值。以最佳 MOI 值感染 BMSCs作為實驗組，空載體轉(zhuǎn)染的 BMSCs（空載體組）及未轉(zhuǎn)染的 BMSCs（空白組）作為對照，通過 RT-PCR、免疫組織化學(xué)染色、Western blot檢測 BMP-2 mRNA及蛋白在 BMSCs 中的表達(dá)，并應(yīng)用ALP染色、ALP活性檢測及茜素紅鈣結(jié)節(jié)染色檢測其成骨分化情況。 結(jié)果經(jīng)RT-PCR基因測序鑒定 BMP-2基因重組慢病毒載體構(gòu)建成功，轉(zhuǎn)染 BMSCs后熒光顯微鏡下可見綠色熒光表達(dá)，且MOI值為 100 時為最佳表達(dá)。RT-PCR 提示 BMP-2 基因成功轉(zhuǎn)染至 BMSCs 中；免疫組織化學(xué)染色及 Western blot檢測示轉(zhuǎn)染后BMSCs并可持續(xù)、穩(wěn)定、高效表達(dá) BMP-2蛋白；培養(yǎng)后2周BMSCs可見ALP表達(dá)及鈣結(jié)節(jié)形成。 結(jié)論成功構(gòu)建 BMP-2基因重組慢病毒載體并轉(zhuǎn)染豬 BMSCs，BMP-2 基因轉(zhuǎn)染入 BMSCs 后能持續(xù)、穩(wěn)定、高效表達(dá) BMP-2 基因和蛋白，并成功誘導(dǎo) BMSCs 向成骨細(xì)胞分 化。
目的探討微小RNA-451（micro RNA-451，miRNA-451）靶向調(diào)節(jié)鈣結(jié)合蛋白39（calcium binding protein 39，CAB39）表達(dá)，促進(jìn)MSCs向成骨細(xì)胞分化的效應(yīng)。 方法選擇pMIR-report質(zhì)粒及pRL-TK質(zhì)粒，通過雙熒光素酶基因報告系統(tǒng)，鑒定CAB39是否為miRNA-451的靶基因。將pre-miRNA-451（A組）及anti-miRNA-451（C組）分別轉(zhuǎn)染到C3H10T1/2細(xì)胞中，同時設(shè)置相應(yīng)的pre-miRNA陰性對照組（B組）和anti-miRNA陰性對照組（D組）；成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)7、14 d，采用實時熒光定量PCR檢測成骨標(biāo)志物Runx2、ALP mRNA相對表達(dá)量；誘導(dǎo)培養(yǎng)14 d，采用Western blot檢測細(xì)胞中CAB39蛋白表達(dá)，茜素紅染色觀察細(xì)胞外鈣基質(zhì)沉積情況。 結(jié)果經(jīng)鑒定，CAB39是miRNA-451的靶基因。實時熒光定量PCR檢測示，成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)7、14 d，A組Runx2、ALP mRNA相對表達(dá)量顯著高于B組，C組顯著低于D組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P lt; 0.05）。成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)14 d，Western blot檢測示A組CAB39蛋白表達(dá)量為0.55 ± 0.05，較B組1.00 ± 0.07明顯降低；而C組為1.21 ± 0.05，較D組1.00 ± 0.04明顯增高；差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P lt; 0.05）。茜素紅染色示A組細(xì)胞外鈣基質(zhì)沉積較B組明顯增多，而C組細(xì)胞外鈣基質(zhì)沉積較D組明顯減少。 結(jié)論miRNA-451可通過抑制CAB39表達(dá)，促進(jìn)MSCs成骨分化。
目的 地塞米松是MSCs 成骨誘導(dǎo)分化的基礎(chǔ)試劑，探討誘導(dǎo)脂肪干細(xì)胞（adipose-derived stem cells，ADSCs）成骨分化過程中地塞米松的優(yōu)選濃度，為進(jìn)一步骨組織工程研究提供理論依據(jù)。 方法 3 月齡清潔級健康新西蘭大白兔5 只，雌雄不限，體重2 ～ 3 kg。取腹股溝區(qū)皮下脂肪4 ～ 6 mL，采用膠原酶消化離心貼壁法分離培養(yǎng)ADSCs，取第3 代細(xì)胞進(jìn)行實驗。倒置相差顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)變化；聯(lián)合CD44、CD106 免疫熒光染色和成脂誘導(dǎo)分化鑒定ADSCs。調(diào)整細(xì)胞密度為1 × 105 個/mL，分別用普通培養(yǎng)液（A 組）及含0（B 組）、1 × 10-9（C 組）、1 × 10-8（D 組）、1 ×10-7（E 組）、1 × 10-6（F 組）、1 × 10-5 mol/L（G 組）地塞米松的成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)液對ADSCs 進(jìn)行培養(yǎng)。MTT 法檢測細(xì)胞增殖情況；RT-PCR 檢測誘導(dǎo)細(xì)胞骨鈣素（osteocalcin，OC）和核心結(jié)合因子α1（core binding factor α1，Cbfα1）的表達(dá)；測定ALP 活性及礦化面積百分率；對礦化結(jié)節(jié)行茜素紅染色。 結(jié)果 ADSCs 形態(tài)多為梭形、多角形，呈“漩渦狀”排列；表面抗原分子CD44 呈陽性，CD106 呈陰性，成脂誘導(dǎo)后可觀察到細(xì)胞內(nèi)有脂滴形成，油紅O 染色呈陽性。MTT 檢測顯示隨地塞米松濃度升高，吸光度（A）值呈下降趨勢；其中成骨誘導(dǎo)5、7 d 時，D、E 組A 值比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P lt; 0.05）。RT-PCR 檢測示，成骨誘導(dǎo)7 d OC 和Cbfα1 mRNA 的表達(dá)分別在E 組和D 組達(dá)高峰；成骨誘導(dǎo)14 d ALP 活性和礦化面積百分率均在D 組達(dá)高峰，隨后逐漸下降。D、E 組間OC 和Cbfα1 mRNA 的表達(dá)量、ALP 活性及礦化面積百分率比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P gt; 0.05），與其余各組比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P lt; 0.05）。成骨誘導(dǎo)14 d，G 組細(xì)胞均死亡；茜素紅染色除A、G 組外均呈陽性。 結(jié)論 成骨培養(yǎng)液中地塞米松濃度為1 × 10-8 mol/L 時，能在減少對細(xì)胞增殖抑制的同時，更有效地誘導(dǎo)ADSCs 成骨分化。
目的 既往研究表明辛伐他汀具有促成骨作用，現(xiàn)探討辛伐他汀對幼鼠骨小梁中骨形成相關(guān)因子表達(dá)以及BMSCs 成骨分化的影響。 方法 40 只1 周齡雄性SD 大鼠，體重17.5 ～ 19.5 g，隨機(jī)分為2 組，每組20 只。實驗組于大鼠頸部皮下注射辛伐他汀注射液[5 mg/（kg·d）]，對照組同法注射等劑量生理鹽水。于注射后1、3 周，兩組分別脫頸處死10 只大鼠，采用免疫組織化學(xué)染色檢測脛骨上端骨小梁BMP-2、基質(zhì)金屬蛋白酶13（matrix metalloproteinase 13，MMP-13）、VEGF 的表達(dá)情況。注射后1、3 周，兩組分別取大鼠雙側(cè)股骨，采用全骨髓培養(yǎng)法體外分離培養(yǎng)BMSCs，取第1 代BMSCs 成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)，培養(yǎng)后14 d 行ALP 染色，培養(yǎng)后21 d 采用實時熒光定量PCR 檢測BMP-2、Runx2、Osterix、Msx2、Dlx3、Dlx5 mRNA 的表達(dá)，培養(yǎng)后28 d 行von Kossa 染色。 結(jié)果 免疫組織化學(xué)染色示注射后1、3 周兩組脛骨上端骨小梁BMP-2、MMP-13、VEGF 表達(dá)，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P gt; 0.05）。成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)14 d，注射后1、3 周兩組ALP染色陽性細(xì)胞百分比差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P gt; 0.05）；成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)21 d，實時熒光定量PCR 檢測示注射后1、3 周兩組BMP-2、Runx2、Osterix、Dlx3、Dlx5、Msx2 mRNA 表達(dá)水平比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P gt; 0.05）；成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)28 d，注射后1、3 周兩組鈣結(jié)節(jié)單位面積比差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P gt; 0.05）。 結(jié)論 皮下注射辛伐他汀5 mg/（kg·d）后1、3 周對幼鼠骨小梁中骨形成相關(guān)因子表達(dá)以及BMSCs 成骨分化無明顯影響。
目的 磷酸鈣生物材料由于其優(yōu)良的生物相容性而具有廣闊的應(yīng)用前景，但傳統(tǒng)方法難以制備具有復(fù)雜形狀的支架。以快速成形方法制備磷酸鈣多孔陶瓷支架材料，并對其體外成骨性能進(jìn)行初步研究。 方法 采用快速成形方法制備磷酸鈣多孔陶瓷支架材料（直徑10 mm、高度5 mm、孔徑800 μm），取Beagle 犬髂骨髓分離培養(yǎng)BMSCs，接種第3 代BMSCs 于支架材料上。將實驗分為4 組，A 組為成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)的細(xì)胞/ 材料復(fù)合物組，B 組為未經(jīng)成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)的細(xì)胞/ 材料復(fù)合物組，另設(shè)平皿成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)及常規(guī)培養(yǎng)為陽性對照組（C 組）及陰性對照組（D 組）。于接種后第1、3、7 天，利用DNA 定量檢測方法及ALP 定量、定性檢測方法檢測BMSCs 在支架材料上的增殖及ALP 的表達(dá)；并經(jīng)DiO 熒光染色后，應(yīng)用激光共聚焦顯微鏡觀察BMSCs 在材料上的黏附生長情況。 結(jié)果 DNA定量結(jié)果表明，隨培養(yǎng)時間增加，C、D 組在第3 天時細(xì)胞生長進(jìn)入平臺期；A、B 組細(xì)胞呈持續(xù)增長趨勢，細(xì)胞培養(yǎng)過程中增殖速度均略低于C、D 組，且未出現(xiàn)明顯的平臺期。DiO 熒光染色示，BMSCs 在以快速成形方法制備的磷酸鈣多孔陶瓷支架材料上黏附、生長狀態(tài)良好。ALP 染色示，隨培養(yǎng)時間延長，A、B 組支架上細(xì)胞染色均逐漸加深，A 組各時間點染色程度均明顯強(qiáng)于B 組。培養(yǎng)后第1、3 天，4 組ALP 表達(dá)均較低，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P gt; 0.05）；培養(yǎng)第7 天，各組ALP 表達(dá)均明顯升高，A 組比其他各組明顯高表達(dá)（P lt; 0.05），B 組及C 組均明顯高于D 組（P lt; 0.05）。 結(jié)論 快速成形的多孔磷酸鈣陶瓷具有良好的細(xì)胞相容性，BMSCs 與支架復(fù)合在體外誘導(dǎo)培養(yǎng)可以進(jìn)行成骨分化。因此通過快速成形技術(shù)制備的磷酸鈣多孔陶瓷是骨組織工程可選的細(xì)胞支架。
目的 綜述Hedgehog 信號通路對MSCs 的增殖和多向分化的調(diào)控。 方法 查閱并綜合分析近年有關(guān)Hedgehog 信號通路對MSCs 生物學(xué)特性調(diào)控的文獻(xiàn)，并進(jìn)行綜述。 結(jié)果 Hedgehog 信號通路促進(jìn)MSCs 的增殖，并在其成骨、成軟骨分化中發(fā)揮重要作用，抑制其成脂分化。 結(jié)論 Hedgehog 信號通路對MSCs 增殖與多向分化調(diào)控的功能可作為組織或器官缺血、骨質(zhì)疏松、軟骨發(fā)育不全和肥胖癥等新的治療靶點。
目的 脂肪來源干細(xì)胞（adipose-derived stem cells，ADSCs）是組織工程種子細(xì)胞的重要來源之一。探討低溫保存對hADSCs 體外生長特性及成骨分化潛能的影響，驗證凍存后的ADSCs 作為組織工程骨種子細(xì)胞的可行性。 方法 取自愿捐獻(xiàn)的經(jīng)脂肪抽吸術(shù)獲取人脂肪組織，采用膠原酶消化法分離hADSCs。取第2 代hADSCs 置于— 196℃液氮保存4 周后，37℃復(fù)蘇并測定細(xì)胞存活率。實驗分為兩組，實驗組為低溫保存的hADSCs，對照組為未經(jīng)低溫保存的hADSCs；均用成骨誘導(dǎo)液誘導(dǎo)培養(yǎng)。采用DNA 定量（Hoechst33258 熒光比色法）測定細(xì)胞體外增殖活性，ALP 染色及茜素紅染色法測定ALP 活性和Ca2+ 含量，觀察低溫凍存對細(xì)胞成骨能力的影響。 結(jié)果 低溫凍存復(fù)蘇后的hADSCs 存活率為90.44% ± 2.62%。兩組細(xì)胞數(shù)量隨成骨誘導(dǎo)時間延長不斷增加，7 d 達(dá)平臺期；ALP 表達(dá)活性也不斷增加，于成骨誘導(dǎo)11 d 達(dá)平臺期，且2 周時ALP 染色均呈陽性；成骨誘導(dǎo)3 周時兩組茜素紅染色均呈強(qiáng)陽性反應(yīng)。兩組各時間點細(xì)胞數(shù)量、ALP 活性和Ca2+ 含量比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P gt; 0.05）。 結(jié)論 低溫保存的hADSCs 體外生長及成骨能力未發(fā)生顯著變化，可以作為組織工程骨的種子細(xì)胞。
目的 探討瘦素（leptin，LEP）對 hBMSCs 成骨分化的作用及機(jī)制。 方法 采用全骨髓法培養(yǎng)hBMSCs，取第3 代hBMSCs 分為A、B、C、D、E、F 組，待細(xì)胞貼壁后各組分別加入400、200、100、50 ng/mL LEP 、100 ng/ mL BMP 和普通培養(yǎng)基2 mL 進(jìn)行培養(yǎng)。于培養(yǎng)后7 d 行ALP 染色、21 d 行礦化結(jié)節(jié)染色，倒置相差顯微鏡觀察染色結(jié)果；并于培養(yǎng)后7、14、21 d，檢測各組ALP 活性、骨鈣素（osteocalcin，OCN）水平，篩選 LEP 的最佳誘導(dǎo)濃度；B、E、F 組細(xì)胞培養(yǎng)7 d 后，采用 RT-PCR 檢測成骨相關(guān)基因：核心結(jié)合因子（core-binding factor α1，Cbfα1）、ALP、Col Ⅰ、OCN mRNA 的表達(dá)。 結(jié)果 誘導(dǎo)培養(yǎng)7 d，ALP 染色結(jié)果顯示，A、B、C、D、E 組細(xì)胞胞漿均呈藍(lán)色陽性著色，F(xiàn) 組呈弱陽性；誘導(dǎo)培養(yǎng)21 d，礦化結(jié)節(jié)染色結(jié)果顯示，A、B、C、D、E 組細(xì)胞染色呈陽性，F(xiàn) 組呈陰性。B 組培養(yǎng)后7、14、21 d，ALP、OCN 活性低于 E 組，但顯著高于其余各組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P lt; 0.05），200 ng/mL LEP 為最佳濃度。B、E、F組細(xì)胞培養(yǎng)7 d，F(xiàn) 組Cbfα1、ALP、Col Ⅰ、OCN mRNA 均不表達(dá)；B、E 組各產(chǎn)物mRNA 均有表達(dá)，但B 組低于E 組。 結(jié)論 LEP 可促進(jìn) hBMSCs 成骨分化，其機(jī)制可能為LEP 促進(jìn)了成骨相關(guān)基因的表達(dá)
目的 探討成骨細(xì)胞特異性鈣黏蛋白（cadherin ectodomain Ⅱ，Cad- Ⅱ）涂布于同種異體脫鈣骨基質(zhì)材料（freeze-dried demineralized bone matrix，F(xiàn)DBM）對兔BMSCs 黏附、增殖及成骨分化能力的影響。 方法 取4 周齡日本大耳白兔10 只，體重0.61 ～ 0.88 kg，雌雄不限，常規(guī)分離培養(yǎng)BMSCs。取第2 代BMSCs（細(xì)胞密度1 × 106 個 /mL）分別與經(jīng)Cad- Ⅱ修飾的FDBM（實驗組）和未經(jīng)Cad- Ⅱ修飾的FDBM（對照組）復(fù)合，行MTT 檢測細(xì)胞增殖能力，細(xì)胞黏附實驗檢測細(xì)胞上架率和上架數(shù)，倒置相差顯微鏡、掃描電鏡及HE 染色觀察細(xì)胞生長情況。另取第2 代BMSCs（細(xì)胞密度5 × 105 個/mL）分別與經(jīng)Cad- Ⅱ修飾的FDBM（實驗組）和未經(jīng)Cad- Ⅱ修飾的FDBM（對照組）復(fù)合培養(yǎng)，行ALP 活性檢測和骨鈣素免疫組織化學(xué)染色觀察細(xì)胞成骨分化情況。 結(jié)果 MTT 檢測發(fā)現(xiàn)BMSCs 在經(jīng)Cad- Ⅱ修飾的支架材料上能正常增殖，但與對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P gt; 0.05）。實驗組細(xì)胞上架率為87.41% ± 5.19%，明顯高于對照組35.56% ± 1.75%（P lt; 0.01）；對照組每片材料細(xì)胞上架數(shù)平均為 2.6 × 104 個，實驗組平均高達(dá)5.0 × 105 個，明顯多于對照組（P lt; 0.05）。倒置相差顯微鏡、掃描電鏡及HE 染色觀察均顯示實驗組支架上黏附細(xì)胞數(shù)量明顯多于對照組。成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)7 d，實驗組和對照組細(xì)胞均可表達(dá)骨鈣素，具有成骨細(xì)胞表型；培養(yǎng)14 d，實驗組和對照組ALP 活性分別為29.33 ± 1.53 和18.31 ± 1.32，骨鈣素免疫組織化學(xué)染色陽性率分別為83% ± 7% 和56% ± 7%，兩組比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P lt; 0.01）；與同組7、21 d 比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（Plt; 0.01），7 d 與21 d 組間及組內(nèi)比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P gt;0.05）。 結(jié)論 Cad- Ⅱ修飾的FDBM 對BMSCs 增殖無明顯促進(jìn)作用，但能提高細(xì)胞黏附性，并促進(jìn)BMSCs 向成骨細(xì)胞分化。