目的 綜述國內(nèi)外應(yīng)用神經(jīng)肌肉電刺激（neuromuscular electrical stimulation，NMES）治療周圍神經(jīng)損傷的機制、參數(shù)選擇、臨床應(yīng)用等研究進展。 方法 檢索近年來NMES 治療周圍神經(jīng)損傷的國內(nèi)外相關(guān)文獻，綜述分析相關(guān)研究進展。 結(jié)果 NMES 治療周圍神經(jīng)損傷應(yīng)在個體化參數(shù)、合適刺激方式下早期應(yīng)用，具有促進神經(jīng)再生、預(yù)防肌肉萎縮的作用。 結(jié)論 NMES 臨床應(yīng)用安全、有效，植入式電刺激有望成為治療神經(jīng)斷裂傷的較佳選擇。
目的 研究灌注式生物反應(yīng)器中流體剪切力和物質(zhì)轉(zhuǎn)運在大段組織工程骨構(gòu)建過程中的作用。 方 法 抽取健康志愿者髂嵴處骨髓20 mL，分離、培養(yǎng)hBMSCs。將第3 代hBMSCs 與大段β-TCP 支架復(fù)合后，在灌注式生物反應(yīng)器中灌注培養(yǎng)28 d。灌注過程中，通過改變培養(yǎng)基黏度或灌流量，對接種在支架上的hBMSCs 施加不同流體剪切力（1、2、3 倍）或給予不同速率（3、6、9 mL/min）的物質(zhì)轉(zhuǎn)運。培養(yǎng)結(jié)束后，對接種在支架上的細胞行增殖及ALP 活性檢測，同時對細胞/ 支架復(fù)合體進行組織學(xué)觀察及形態(tài)學(xué)計量。 結(jié)果 灌流量均為3 mL/min 時，流體剪切力2 倍組的細胞活性高于其他各組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P lt; 0.05）；當(dāng)流體剪切力均為3 倍時，3、6、9 mL/min 灌流量組細胞活性差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P gt; 0.05）。當(dāng)灌流量均為3 mL/min 時，流體剪切力2 倍組和3 倍組的ALP 活性高于1 倍組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P lt; 0.05）；當(dāng)流體剪切力均為3 倍時，灌流量為6 mL/min 組的ALP 活性最高（Plt; 0.05）。灌注培養(yǎng)28 d 后，各組ECM 分布于整個β-TCP 支架內(nèi)，灌流量均為3 mL/min 時，增加流體剪切力有利于支架內(nèi)ECM 形成及礦化；當(dāng)流體剪切力均為3 倍時，增加灌流量使ECM 的礦化減少。 結(jié)論 流體剪切力和物質(zhì)轉(zhuǎn)運兩個流體動力學(xué)參數(shù)是影響大段組織工程骨構(gòu)建的重要因素。在構(gòu)建大段組織工程骨過程中，應(yīng)調(diào)節(jié)流體動力學(xué)參數(shù)使其對組織工程骨的構(gòu)建發(fā)揮最佳效應(yīng)。
目的 觀察重組人骨形成蛋白2（recombined human bone morphogenetic protein 2, rhBMP-2）異位誘導(dǎo)成骨過程中神經(jīng)生長因子（nerve growth factor, NGF）及其高親和力受體（tyrosine kinase receptor A, TrkA）的表達，探討NGF在BMP骨誘導(dǎo)中的作用。 方法 ICR小鼠36只，隨機分為實驗組和對照組，每組18只，均制備右側(cè)股后部肌袋異位成骨模型。實驗組植入含rhBMP2膠原復(fù)合物，對照組僅植入相同體積的膠原海綿。分別于術(shù)后7、14和21 d取材，行大體、組織學(xué)、免疫組織化學(xué)觀察及RT-PCR檢測。結(jié)果 大體觀察實驗組術(shù)后7 d，右股后部可捫及較硬腫塊；術(shù)后14、21 d，腫塊硬度增加。對照組各時間點未發(fā)現(xiàn)腫塊。組織學(xué)觀察實驗組中rhBMP2膠原復(fù)合物具有良好的誘導(dǎo)成骨能力，免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示骨誘導(dǎo)材料植入后7 d，NGF于成纖維細胞、成軟骨細胞、軟骨細胞、肥大軟骨細胞和成骨細胞中均有陽性表達；14 d，NGF陽性表達局限于部分成骨細胞、幼稚骨細胞和成骨樣細胞，同時在骨髓中單核巨噬細胞、多核巨噬細胞和破骨細胞中有明顯表達；21 d，只有少量成骨樣細胞和破骨細胞以及骨髓中多核巨噬細胞有NGF表達；TrkA免疫組織化學(xué)染色與NGF的表達基本一致。對照組術(shù)后各時間點未見成骨現(xiàn)象。實驗組NGF mRNA的 RT-PCR檢測顯示，術(shù)后7 d NGF的mRNA表達最高，14 d表達下降，21 d只有微量表達。結(jié)論 rhBMP-2復(fù)合物是一種有效的誘導(dǎo)成骨材料。在外源性BMP誘導(dǎo)成骨過程中有明顯的NGF及其高親和力受體TrkA的表達，NGF可以通過直接和間接的方式參與BMP的誘導(dǎo)成骨過程。
目的 利用外源性細胞毒性T淋巴細胞相關(guān)抗原4(cytotoxic T lymphocyte-associated antigen 4 immuno globlin，CTLA4Ig) 阻斷T細胞反應(yīng)的第2信號，誘導(dǎo)新鮮同種異體骨移植免疫耐受。方法 采用近交系小鼠BALB/C 66只作為骨移植的受體，進行異位肌袋一次及第2次骨移植。一次移植分為3組，每組18只，一組移植C57BL/6小鼠骨骼，注射L6（對照品），為AL組；一組移植C57BL/6小鼠骨骼，注射CTLA4-Ig，為AC組；一組移植同系BALB/C小鼠骨骼，注射PBS緩沖液，為AB組。在第2、4及6周，進行血淋巴細胞亞群分析，血清抗體測定，供體細胞及抗原二次刺激實驗及組織學(xué)觀察。另取12只BALB/C小鼠，進行第2次移植實驗，供體為C57BL/6小鼠的骨骼，注射CTLA4-Ig后2周，分別移植C57BL/6（BC組）和C3H（BH組）小鼠的骨骼，檢測產(chǎn)生免疫耐受的特異性。結(jié)果 AL組與AB組比較，產(chǎn)生了強烈的免疫排斥反應(yīng)，移植后2、4及6周，CD4 T細胞的增殖明顯增加（Plt;0.05），血清抗體明顯增多（Plt;0.05）,供體細胞及骨抗原二次刺激的細胞增殖也明顯增加（Plt;0.05）；AC組免疫排斥反應(yīng)較輕，在CD4 T細胞的增殖、血清抗體及二次刺激的細胞增殖方面均與AB組相似（Pgt;0.05）；組織學(xué)觀察也顯示，異體骨周圍的淋巴細胞浸潤消失，軟骨誘導(dǎo)及新骨形成，并出現(xiàn)幼稚的骨髓腔，與AB組相似。第2次移植實驗發(fā)現(xiàn)，BC組無論在CD4亞群增殖還是二次刺激增殖方面均明顯低于BH組，免疫耐受具有供體特異性。結(jié)論 在6周內(nèi)CTLA4-Ig誘導(dǎo)了小鼠新鮮同種異體骨移植免疫耐受，這為解決骨移植免疫反應(yīng)問題開辟了嶄新的途徑，并為其他器官移植提供了重要的理論依據(jù)。
目的研究人工全髖關(guān)節(jié)假體無菌性松動后假體周圍組織的血管化程度，探討其與假體周圍骨溶解的關(guān)系。 方法取2009年10月-2012年6月22例（22髖）因假體無菌性松動行髖關(guān)節(jié)翻修術(shù)患者假體周圍界膜組織，其中男12例，女10例；年齡53～81歲；假體使用壽命6～14年。術(shù)中根據(jù)假體周圍標準分區(qū)法，結(jié)合術(shù)前影像學(xué)表現(xiàn)，將假體周圍界膜組織分為骨溶解區(qū)組和非骨溶解區(qū)組。另取同期8例（8髖）行人工全髖關(guān)節(jié)置換的骨關(guān)節(jié)炎患者滑膜組織作為對照組，其中男3例，女5例；年齡58～72歲。行HE染色觀察組織學(xué)特征，根據(jù)骨溶解區(qū)組金屬或聚乙烯顆粒數(shù)量行磨損程度分級。采用CD34免疫組織化學(xué)染色對組織內(nèi)的血管進行標記，計算微血管密度及微血管指數(shù)，比較不同組間血管化程度以及不同磨損程度下血管化程度的變化。 結(jié)果組織學(xué)觀察骨溶解區(qū)組界膜組織中可見磨損顆粒聚集以及單核-巨噬細胞浸潤廣泛，非骨溶解區(qū)組以纖維細胞為主。免疫組織化學(xué)染色示，非骨溶解區(qū)組微血管密度和微血管指數(shù)較骨溶解區(qū)組和對照組顯著降低（P＜0.05）；骨溶解區(qū)組以上指標較對照組低，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。金屬、聚乙烯顆粒重度磨損組織微血管密度和微血管指數(shù)均較對應(yīng)的輕度磨損組織明顯減少（P＜0.05）；相同磨損程度時，聚乙烯磨損顆粒以上指標均較金屬磨損顆粒高，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。 結(jié)論界膜組織內(nèi)單核細胞發(fā)揮吞噬功能需要一定數(shù)量的微血管和血供，假體-骨界面組織微血管損傷或者血供減少，可能是造成假體周圍骨整合不良和假體無菌性松動的重要原因。
體外分離培養(yǎng)豬滑膜源性MSCs（synovium-derived MSCs，SMSCs），探討其在體外多向分化潛能。 方法 2 月齡長楓雜交豬3 頭，雌雄不限，體重8 ～ 10 kg。取豬膝關(guān)節(jié)滑膜組織分離SMSCs 并行原代及傳代培養(yǎng)，待第3 代SMSCs 長滿培養(yǎng)皿后，吸去基礎(chǔ)培養(yǎng)液，分別加入特定培養(yǎng)液進行成軟骨、成骨、成脂誘導(dǎo)分化，作為實驗組；以基礎(chǔ)培養(yǎng)液培養(yǎng)作為對照組。成軟骨誘導(dǎo)21 d 后行甲苯胺藍染色、免疫組織化學(xué)染色和實時熒光定量 PCR 檢測；成骨誘導(dǎo)10 d 后行ALP 染色檢測，21 d 后行茜素紅染色檢測；成脂誘導(dǎo)21 d 后行油紅O 染色檢測。 結(jié)果 SMSCs 培養(yǎng)24 h后細胞形態(tài)細長或呈多角形；48 h 后細胞數(shù)量增多；72 h 后可見大量紡錘形細胞，其間散在分布少許小圓形細胞。實驗組成軟骨誘導(dǎo)21 d 后甲苯胺藍染色呈陽性，細胞外有蛋白多糖（Aggrecan）形成；免疫組織化學(xué)染色示特異軟骨基質(zhì)Col Ⅱ表達；實時熒光定量PCR 檢測示Col Ⅱ A1、Aggrecan、SOX9 mRNA 表達量與對照組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P lt; 0.05）。成骨誘導(dǎo)10 d 后ALP 染色陽性，21d 后茜素紅染色陽性，有鈣結(jié)節(jié)形成。成脂誘導(dǎo)21 d 后油紅O 染色示細胞內(nèi)有脂滴形成。對照組除ALP 染色觀察呈弱陽性外，余染色均呈陰性。 結(jié)論 豬膝關(guān)節(jié)滑膜組織可分離獲取SMSCs，其在體外具有向成軟骨、成骨、成脂多向分化潛能，有望成為組織工程種子細胞來源。
【摘 要】 目的 評價HA 復(fù)合rhBMP-2 的腺病毒（adenovirus mediated rhBMP-2，Adv-rhBMP-2）轉(zhuǎn)染的羊BMSCs 對骨痂延長骨愈合的影響。 方法 成年山羊19 只，雌雄不限，體重15 ～ 20 kg。于每只羊髂嵴上穿刺抽取骨髓10 mL，常規(guī)傳代培養(yǎng)BMSCs。取第3 代BMSCs，以感染復(fù)數(shù)200 轉(zhuǎn)染腺病毒。取0.25% 胰蛋白酶消化轉(zhuǎn)染后3 d 的細胞1 ×108 個，與HA 充分混勻制備Adv-rhBMP-2/BMSCs/HA。建立山羊右側(cè)脛骨延長模型，術(shù)后立即于截骨部位注射自體細胞復(fù)合物。按術(shù)后注入物質(zhì)不同隨機分成4 組：A 組為Adv-rhBMP-2/BMSCs/HA 組（n=6），B 組為Adv-rhBMP-2/BMSCs 組（n=5），C 組為Adv-β-gal/BMSCs/HA 組（n=4），D 組為空白組（n=4）。術(shù)后第7 天開始行脛骨延長，速度1 mm/d，共延長4 周。術(shù)后5、8、12 周攝X 線片觀察骨痂生長情況，12 周處死動物，取標本分別行骨密度檢測、生物力學(xué)測定、組織學(xué)觀察和骨形態(tài)計量學(xué)分析。 結(jié)果 X 線片檢查示，術(shù)后5、8 周A、B 組骨痂生成量明顯多于C、D 組，X 線片定量評分A、B 組明顯高于C、D 組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P lt; 0.05）；12 周各組均在骨延長部位形成連續(xù)骨痂。骨密度測定：術(shù)后12 周A、B、C、D 組延長部位骨礦物質(zhì)含量分別為（4.175 ± 1.921）、（2.600 ± 0.638）、（2.425 ± 0.826）和（1.175 ± 0.574） g，骨礦物質(zhì)密度分別為（0.612 ± 0.196）、（0.630 ± 0.159）、（0.450 ± 0.166）和（0.266 ± 0.113）g/cm2，A、B 組顯著高于C、D組（P lt; 0.05）。生物力學(xué)測定：A、B、C、D 組最大載荷分別為（490.20 ± 155.08）、（350.59 ± 80.48）、（221.95 ± 68.79）和（150.65 ± 92.29）N，彈性模量為（178.24 ± 105.80）、（105.88 ± 27.09）、（81.18 ± 48.67）和（50.35 ± 47.64）MPa，各指標A組顯著高于C、D 組（P lt; 0.05）。組織學(xué)觀察見A 組骨延長處大量新生骨組織，骨小梁多為縱行網(wǎng)狀排列。骨形態(tài)計量分析示A、B、C、D 組新骨體積分別為72.35% ± 5.68%、67.58% ± 7.42%、49.63% ± 4.87% 和38.87% ± 2.35%，A 組新生骨生成量明顯比D 組多（P lt; 0.05）。 結(jié)論 HA 復(fù)合rhBMP-2 修飾的BMSCs 制備的組織工程骨可促進羊脛骨延長骨愈合。
構(gòu)建含人IL-1 受體拮抗蛋白（IL-1 receptor antagonist，IL-1Ra）逆轉(zhuǎn)錄病毒表達載體（PLXRNIL-1Ra），體外轉(zhuǎn)染人骨關(guān)節(jié)炎（osteoarthritis，OA）軟骨細胞，研究其相關(guān)特性。 方法 利用細菌內(nèi)同源重組技術(shù)快速構(gòu)建PLXRN-IL-1Ra 逆轉(zhuǎn)錄病毒重組質(zhì)粒，經(jīng)測序及酶切鑒定正確后轉(zhuǎn)染PT67 細胞，包裝成為重組PLXRN-IL-1Ra 逆轉(zhuǎn)錄病毒，并使用小鼠腎成纖維細胞系NIH/3T3 對病毒進行滴度測定。實驗分為3 組：未轉(zhuǎn)染組（A 組）、PLXRN 空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組（B 組）、PLXRN-IL-1Ra 轉(zhuǎn)染組（C 組），病毒感染人OA 軟骨細胞后，RT-PCR 檢測細胞內(nèi)IL-1Ra 基因的轉(zhuǎn)錄和表達；ELISA 法檢測細胞培養(yǎng)上清液中人IL-1Ra 蛋白表達。 結(jié)果 酶切鑒定及基因測序證實重組逆轉(zhuǎn)錄病毒質(zhì)粒中含有人IL-1Ra cDNA，測定包裝的病毒滴度為3 × 104 CFU/mL。原代軟骨細胞體外培養(yǎng)呈多角形或梭形，甲苯胺藍染色見細胞內(nèi)有紫色異染顆粒。RT-PCR 結(jié)果顯示在C 組出現(xiàn)311 bp 人IL-1Ra mRNA 片段，A、B 組未見人IL-1Ra mRNA 的表達帶，GAPDH 在各組均有表達。ELISA 檢測發(fā)現(xiàn)C 組細胞上清有一定量的人IL-1Ra 表達，蛋白濃度為（60.47 ± 15.13）ng/L，A 組和B 組均無人IL-1Ra 表達。 結(jié)論 構(gòu)建的IL-1Ra 逆轉(zhuǎn)錄病毒表達載體成功地感染人OA 軟骨細胞，并在體外獲得穩(wěn)定表達，為將表達人IL-1Ra 基因的人OA 軟骨細胞用于OA 基因治療提供了實驗依據(jù)。