目的 闡明有關(guān)基質(zhì)金屬蛋白酶-1(MMP-1)在皮膚損傷后，表皮修復(fù)過(guò)程中的作用。方法 回顧近年來(lái)有關(guān)MMP- 1在皮膚損傷修復(fù)中的作用及研究進(jìn)展，總結(jié)其在上皮化局部微小環(huán)境內(nèi)的表達(dá)及細(xì)胞分子生物學(xué)效應(yīng)。結(jié)果 皮膚損傷信號(hào)直接引發(fā)表皮細(xì)胞于特定的部位及時(shí)間表達(dá)MMP-1;MMP-1通過(guò)特異性分解創(chuàng)面基質(zhì)膠原蛋白，促進(jìn)表皮細(xì)胞的增殖及遷移，由此影響表皮損傷創(chuàng)面的愈合結(jié)果。結(jié)論 皮膚損傷后表皮細(xì)胞表達(dá) MMP- 1與創(chuàng)面重新上皮化直接相關(guān)。
目的 對(duì)毛囊干細(xì)胞(hair follicle stem cell，F(xiàn)SC)參與創(chuàng)面修復(fù)過(guò)程及相關(guān)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。 方法 廣泛查閱近年國(guó)內(nèi)外相關(guān)文獻(xiàn)，對(duì)FSC定位、細(xì)胞表面標(biāo)記物、與創(chuàng)面修復(fù)的關(guān)系及相關(guān)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路研究進(jìn)展進(jìn)行回顧總結(jié)與分析。 結(jié)果 FSC在維持毛囊循環(huán)和創(chuàng)面修復(fù)中具有重要作用。已知參與調(diào)控這一過(guò)程的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路有 Wnt、骨形成蛋白/轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β、Notch、Shh和成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子等。 結(jié)論 FSC在創(chuàng)面修復(fù)等再生醫(yī)學(xué)中有廣闊的應(yīng)用前景，有關(guān)其增殖分化調(diào)控的研究將成為創(chuàng)面修復(fù)及組織工程等領(lǐng)域內(nèi)新的研究熱點(diǎn)。
目的探討角質(zhì)形成細(xì)胞（keratinocytes，KC）熱損傷后對(duì)真皮成纖維細(xì)胞（fibroblasts，F(xiàn)b）Ⅰ、Ⅲ型膠原及基質(zhì)金屬蛋白酶1（matrix metalloproteinase 1，MMP-1）表達(dá)的影響。 方法分離培養(yǎng)人正常Fb及KC，分別建立KC、Fb熱損傷模型；收集正常及熱損傷12 h后細(xì)胞培養(yǎng)上清，并配制成濃度為50%的細(xì)胞條件培養(yǎng)液。根據(jù)培養(yǎng)液不同將第3～5代Fb分為3組，分別采用含50%熱損傷KC培養(yǎng)上清（A組）、含50%正常KC培養(yǎng)上清（B組）的條件培養(yǎng)液及單純DMEM（C組）培養(yǎng)，24 h后收集3組細(xì)胞；另于培養(yǎng)0、1、2、6、12、24、48 h分別收集A組細(xì)胞。采用含50%熱損傷Fb培養(yǎng)上清的條件培養(yǎng)液培養(yǎng)Fb，于0、1、2、6、12、24、48 h收集細(xì)胞。采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)各時(shí)間點(diǎn)KC熱損傷條件培養(yǎng)上清對(duì) Fb Ⅰ、Ⅲ型膠原及MMP-1 mRNA表達(dá)影響，以及Fb熱損傷條件培養(yǎng)上清對(duì)Fb MMP-1 mRNA表達(dá)影響。 結(jié)果KC熱損傷條件培養(yǎng)上清培養(yǎng)24 h，A組Ⅰ、Ⅲ型膠原及MMP-1 mRNA相對(duì)表達(dá)量均顯著高于B、C組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P lt; 0.05）。培養(yǎng)2、6、12、24、48 h，A組Ⅰ、Ⅲ型膠原及MMP-1 mRNA相對(duì)表達(dá)量均高于0 h（P lt; 0.05），1 h與0 h差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P gt; 0.05）；隨培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)相對(duì)表達(dá)量逐漸增高，2 h后各時(shí)間點(diǎn)間比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P lt; 0.05）。Fb熱損傷條件培養(yǎng)上清培養(yǎng)1、2、6、12、24、48 h，MMP-1 mRNA相對(duì)表達(dá)量與0 h比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P lt; 0.05）；培養(yǎng)2 h后相對(duì)表達(dá)量逐漸降低，各時(shí)間點(diǎn)間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P lt; 0.05）。 結(jié)論熱損傷后KC培養(yǎng)上清對(duì)Fb Ⅰ、Ⅲ型膠原及MMP-1的表達(dá)具有調(diào)控作用。
【摘 要】 目的 體外觀察白芷活性提取物對(duì)人皮膚角質(zhì)形成細(xì)胞（keratinocytes，KC）生物學(xué)特性的影響，初步探討其促進(jìn)創(chuàng)面愈合的可能機(jī)制。 方法 取人皮膚KC的HaCaT細(xì)胞株，復(fù)蘇培養(yǎng)取第5代細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。取白芷生藥95%乙醇提取后，將其活性提取物溶解于含0.25% FBS的DMEM培養(yǎng)液中，稀釋至5 × 10-2、5 × 10-3、5 × 10-4、5 × 10-5 g/L，分別與KC培養(yǎng)5 d后采用MTT法測(cè)定細(xì)胞增殖活性，以含0.25% FBS的DMEM培養(yǎng)作為對(duì)照。根據(jù)細(xì)胞增殖活性確定最佳濃度后，取KC分別采用最佳濃度白芷活性提取液（實(shí)驗(yàn)組）及含0.25% FBS的DMEM（對(duì)照組）培養(yǎng)。培養(yǎng)48 h后流式細(xì)胞儀測(cè)定細(xì)胞周期，實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)細(xì)胞周期相關(guān)基因細(xì)胞周期素D1（cyclin D1）、凋亡相關(guān)基因天冬氨酸半胱氨酸酶3（Caspase-3）mRNA 的表達(dá)。 結(jié)果 培養(yǎng)5 d后，MTT測(cè)定5 × 10-4、5 × 10-3、5 × 10-2 g/L濃度可促進(jìn)KC增殖，吸光度（A）值與對(duì)照組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P lt; 0.05）；其中5 × 10-3 g/L濃度組A值最高，確定為最佳濃度。實(shí)驗(yàn)組S期及G2/M期細(xì)胞數(shù)量較對(duì)照組明顯增多，G0/G1期細(xì)胞數(shù)量明顯減少，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P lt; 0.05）。實(shí)驗(yàn)組cyclin D1及Caspase-3 mRNA相對(duì)表達(dá)量均低于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P lt; 0.05）。 結(jié)論 白芷活性提取物能促進(jìn)KC增殖，同時(shí)下調(diào)cyclin D1的表達(dá)加快細(xì)胞周期進(jìn)程，下調(diào)Caspase-3的表達(dá)抑制細(xì)胞凋亡，以加快上皮化進(jìn)程促進(jìn)創(chuàng)面愈合。
分離培養(yǎng)脂肪來(lái)源干細(xì)胞（adipose-derived stem cells，ADSCs），探討胰島素刺激前后其分泌因子的變化及對(duì)人角質(zhì)形成細(xì)胞株 HaCaT 細(xì)胞生物學(xué)影響。 方法 從腹部外科手術(shù)患者自愿捐獻(xiàn)皮下脂肪組織中分離、培養(yǎng) ADSCs，取第3 代ADSCs 調(diào)整密度為 5 × 104 個(gè)/mL，采用1 × 10-7 mol/L 胰島素刺激作為A 組，以未加胰島素刺激作為B 組，培養(yǎng)3 d 后收集兩組ADSCs 培養(yǎng)上清液（conditioned medium of ADSCs，ADSC-CM），ELISA 法測(cè)定其VEGF、肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子（hepatocyte growth factor，HGF）含量。取人角質(zhì)形成細(xì)胞株 HaCaT 細(xì)胞培養(yǎng)，將第4 代細(xì)胞根據(jù)培養(yǎng)液不同分為4 組。A1 組：含A 組ADSC-CM 和2% FBS 各0.5 mL；B1 組：含B 組ADSC-CM 和2% FBS 各0.5 mL；C1組：1 mL 含終濃度為1 × 10-7 mol/L 胰島素的2%FBS；D1 組：僅含2%FBS 1 mL。培養(yǎng)3 d 采用MTT 法測(cè)定HaCaT 細(xì)胞增殖情況；培養(yǎng)12 h Annexin V-FITC 雙染測(cè)定細(xì)胞凋亡情況；培養(yǎng)0、12、24、36、48 h 采用體外細(xì)胞劃痕法測(cè)定其遷移能力。 結(jié)果 A 組 VEGF、HGF 含量分別為（643.28 ± 63.57）、（929.95 ± 67.52）pg/mL，B 組分別為（286.52 ± 46.68）、（576.61 ± 84.29） pg/mL，組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P lt; 0.05）。細(xì)胞增殖測(cè)定A1、B1 組吸光度值分別為0.881 ± 0.039、0.804 ± 0.041，與C1 組（0.663 ± 0.027）及D1 組（0.652 ± 0.042）比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P lt; 0.01）；A1 組高于B1 組（P lt; 0.05）。A1、B1 組凋亡率分別為5.23% ± 1.98%、8.82% ± 2.59%，均低于C1 組（31.70% ± 8.85%）和D1 組（29.60% ±8.41%），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P lt; 0.05），但B1 組凋亡率高于A1 組（P lt; 0.05）。A1 、B1、C1 和D1 組36 h 遷移距離分別為（0.184 6 ± 0.019 2）、（0.159 8 ± 0.029 4）、（0.059 2 ± 0.017 6） 及（0.058 2 ± 0.012 3）mm，48 h 分別為（0.231 8 ± 0.174 0）、（0.205 1 ± 0.012 1）、（0.079 2 ± 0.008 1）及（0.078 4 ± 0.011 7）mm，兩時(shí)間點(diǎn)A1 組和B1 組距離明顯大于C1 組和D1 組（Plt; 0.01），A1 組大于B1 組（P lt; 0.05）；其他時(shí)間點(diǎn)遷移距離差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P gt; 0.05）。 結(jié)論 胰島素干預(yù)后ADSCs能更有效促進(jìn) HaCaT 細(xì)胞增殖、遷移和抑制凋亡。
目的探討吲哚胺2，3-雙加氧酶（indoleamine 2，3-dioxygenase，IDO）基因轉(zhuǎn)染修飾大鼠BMSCs對(duì)同種異體復(fù)合組織移植免疫排斥反應(yīng)的影響及其機(jī)制。 方法以IDO過(guò)表達(dá)慢病毒IDO[綠色熒光蛋白（green fluorescent protein，GFP）]-Lenti轉(zhuǎn)染供體4～6周齡BN大鼠來(lái)源的第3代BMSCs，篩選目的基因高表達(dá)、具有生物活性的細(xì)胞株IDO-BMSCs。行RT-PCR、Western blot檢測(cè)基因修飾前后BMSCs中IDO mRNA及蛋白表達(dá)，通過(guò)測(cè)量培養(yǎng)上清犬尿氨酸生成量檢測(cè)IDO生物學(xué)活性。在混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)體系中以IDO-BMSCs、反應(yīng)細(xì)胞（受體4～6周齡LEWIS大鼠來(lái)源外周血單個(gè)核細(xì)胞）和刺激細(xì)胞（供體BN大鼠來(lái)源外周血單個(gè)核細(xì)胞）混合培養(yǎng)，細(xì)胞比例分別為1∶5∶5、1∶10∶10、1∶50∶50及1∶100∶100（實(shí)驗(yàn)組1、2、3、4）；每個(gè)反應(yīng)體系另設(shè)IDO阻斷孔，加入1 mmol/L IDO特異性抑制劑1-甲基色氨酸（1-methyl-tryptophan，1-MT）；以IDO-BMSCs與反應(yīng)細(xì)胞（1∶5）培養(yǎng)為陰性對(duì)照組，刺激細(xì)胞與反應(yīng)細(xì)胞（1∶1）培養(yǎng)為陽(yáng)性對(duì)照組，IDO-BMSCs在RPMI 1640培養(yǎng)基中單獨(dú)培養(yǎng)作為空白對(duì)照組。于培養(yǎng)5 d，采用MTT法檢測(cè)T淋巴細(xì)胞增殖情況。進(jìn)一步制備大鼠同種異體肢體移植模型，將GFP-BMSCs（A組）、IDO-BMSCs（B組）及生理鹽水（C組）分別經(jīng)尾靜脈輸入移植模型，觀察移植物存活時(shí)間及免疫排斥反應(yīng)。 結(jié)果基因修飾后，BMSCs中IDO mRNA及蛋白表達(dá)顯著提高。IDO-BMSCs較GFP-BMSCs可明顯提高培養(yǎng)上清中犬尿氨酸含量（P＜0.05）。加入1-MT前，實(shí)驗(yàn)組1、2、3的T淋巴細(xì)胞增殖率隨IDO-BMSCs與反應(yīng)細(xì)胞比例逐漸減少而不斷增加，組間比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；實(shí)驗(yàn)組4的T淋巴細(xì)胞增殖率與陽(yáng)性對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。加入1-MT后，除實(shí)驗(yàn)組4的T淋巴細(xì)胞增殖率與加入前比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）外，其余各實(shí)驗(yàn)組均高于加入前（P＜0.05）。體內(nèi)輸入后，IDO-BMSCs可在移植物內(nèi)定植，抑制免疫排斥反應(yīng)的發(fā)生；A、B、C組移植物存活時(shí)間分別為（11.5±0.6）、（14.5±0.8）、（9.0±0.3）d，B組存活時(shí)間明顯長(zhǎng)于A、C組，A組長(zhǎng)于C組（P＜0.05）。 結(jié)論IDO-BMSCs可促進(jìn)大鼠同種異體復(fù)合組織移植物的成活，其機(jī)制與抑制T淋巴細(xì)胞增殖、促進(jìn)BMSCs向移植物內(nèi)定植有關(guān)。
目的 建立人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞（human umbilical vein endothelial cells，HUVECs）體外高效穩(wěn)定培養(yǎng)的方法，為組織工程及相關(guān)醫(yī)學(xué)基礎(chǔ)研究提供穩(wěn)定的細(xì)胞來(lái)源。 方法 取自愿捐贈(zèng)足月妊娠分娩的新生兒臍帶，用自制空針軟管靜脈注入0.1% Ⅱ型膠原酶，置于37℃培養(yǎng)箱中，消化收集，采用含5% FBS 及1% 內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子（endothelial cell growth factor,ECGS）的內(nèi)皮細(xì)胞專用培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。將消化前后的臍帶標(biāo)本行HE 染色，觀察HUVECs 脫壁情況；流式細(xì)胞儀檢測(cè)原代細(xì)胞純度；細(xì)胞培養(yǎng)期間于倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)；取第3 代HUVECs行免疫細(xì)胞化學(xué)染色觀察、MTT 檢測(cè)細(xì)胞增殖情況，并將細(xì)胞接種于細(xì)胞外基質(zhì)膠Matrigel 上培養(yǎng)24 h，觀察細(xì)胞管腔形成情況。 結(jié)果 經(jīng)Ⅱ型膠原酶消化后的臍帶內(nèi)HUVECs 大量脫落，細(xì)胞消化完全。經(jīng)Ⅱ型膠原酶37℃培養(yǎng)箱中消化15 min 后，可獲得純度為 99.56% 的HUVECs；原代HUVECs 培養(yǎng)后2 ～ 3 d 生長(zhǎng)最快，呈典型的鋪路石或鵝卵石樣排列，4 ～ 6 d 融合成片。 MTT 法檢測(cè)顯示第3 代HUVECs 培養(yǎng)后3 ～ 4 d 細(xì)胞生長(zhǎng)最快，5 d 左右融合；免疫細(xì)胞化學(xué)染色顯示內(nèi)皮細(xì)胞Ⅷ因子相關(guān)抗原表達(dá)陽(yáng)性，培養(yǎng)24 h 后在細(xì)胞外基質(zhì)膠Matrigel 上可見類似于毛細(xì)血管的完整閉合管腔形成。 結(jié)論 經(jīng)自制空針軟管靜脈注入0.1%Ⅱ型膠原酶，使靜脈充分充盈，內(nèi)皮消化完全，采用含5%FBS 和1%ECGS的內(nèi)皮細(xì)胞專用培養(yǎng)基，可迅速獲取大量高純度、高存活率的HUVECs。